[发明专利]一种产热稳定性重组胰蛋白酶的酵母工程菌及其应用

权利要求书

1.一种产热稳定性重组胰蛋白酶的酵母工程菌及其应用，其特征在于采用毕赤酵母宿主(Pichia pastoris)GS115为宿主，表达重组胰蛋白酶基因，所述重组胰蛋白酶基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。 

2.权利要求1所述酵母工程菌的构建方法，其特征在于具体步骤为： 

1）热稳定性提高的重组胰蛋白酶基因的获得 

利用融合PCR技术或化学全合成的方法，将人工设计前导肽Ex核苷酸序列和灰色链霉菌（Streptomyces griseu）胰蛋白酶编码基因mt进行融合，并将连接至pMD19Tsimple载体中；所述前导肽Ex核苷酸序列为TACGTTGAATTT； 

2）融合前导肽的重组酶表达质粒的构建 

利用融合PCR技术在其5’端融合Saccharomyces cerevisiaeα-factor信号肽，得到亚克隆片段α-factor signal peptide+Exmt，之后将亚克隆片段利用BamHI和NotI酶切亚克隆至表达载体pPIC9K，获得重组表达质粒pPIC9K-α-factor signal peptide+Exmt； 

3）融合双亲短肽的重组酶表达菌株的构建 

将重组质粒pPIC9K-α-factor signal peptide+Exmt转化宿主毕赤酵母宿主(Pichia pastoris)GS115。 

3.一种应用权利要求1所述所述酵母工程菌发酵生产重组胰蛋白酶的方法，其特征在于以权利要求1所述的酵母工程菌为生产菌株，接种一环转化子入250mL三角瓶，装液量50mL的种子培养基，培养温度28℃～30℃，摇床转速200r/min，培养24h；离心，收集种子，用无菌生理盐水洗涤两次，按10%的接种量接入装液量为50mL发酵培养基的三角瓶中，发酵温度30℃，摇床转速200r/min，发酵时间：3～4天。 

4.权利要求3所述的方法，其特征在于所述种子培养基1L组成为：蛋白胨10-20，酵母提取物5-10，葡萄糖10-20，氯化钠5-15。

5.权利要求3所述的方法，其特征在于所述发酵培养基1L组成为：酵母氮源基础培养基12～15，生物素0.0002～0.0005，甲醇10～50；微量元素溶液，MnSO₄·4H₂O100，ZnCl₂70，Na₂MoO₄·2H₂O35，H₃BO₃60，CoCl₂·6H₂O200，CuSO₄·5H₂O29，NiCl₂·6H₂O25，37%盐酸0.9mL。