[发明专利]一种产热稳定性重组胰蛋白酶的酵母工程菌及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种产热稳定性重组胰蛋白酶的酵母工程菌及其应用，属于遗传工程领域。

背景技术

迄今为止，酶制剂已被广泛地应用于制革、食品、发酵和纺织等行业。酶在制革工业中的应用，最早仅限于酶脱毛和酶软化。随着科学技术的不断发展和进步，酶制剂在制革行业中的应用范围也不断拓展、扩大，逐渐应用于制革准备工段乃至整个制革过程。种种迹象表明，基于酶制剂的制革工艺方法的研究与开发，必将催生具有生态概念的制革新技术——生物制革。其中在制革工业中应用较为广泛且应用时间较长的是胰酶，胰酶是一类广泛应用于医药、食品、化工及制革等工业的混合酶制剂。胰酶最早是通过新鲜动物胰脏来制备，通过绞碎，配料，磨浆，消化，过滤，干燥，球磨等工艺制备成为胰酶原粉，随后加填充剂稀释成为不同酶活力标准的胰酶成品。动物源胰酶成分复杂，其中具有主要作用的是胰蛋白酶(EC3.4.21.4)，虽然胰酶制备简便，但是制备过程比较粗放，产品不同批次间质量参差不齐，品质难以控制，而对其进行精制则成本较大；另外动物源胰酶在皮革工业中存在生物安全性低和标准化困难的缺点；制革工业中常用的的酶为蛋白酶，蛋白酶种类可分为四大类：丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶类、天冬氨酸蛋白酶类和金属蛋白酶类，链霉菌属可以产生其中的除了半胱氨酸蛋白酶类的其他三类蛋白酶，已经发现了多种可产生蛋白酶的链霉菌，主要包括灰色链霉菌（Streptomyces griseu）、变铅青链霉菌（S.lividans）、弗氏链霉菌（S.fradiae）和带小棒链霉菌（S.clavuligerus）等。通过对目前皮革工业中应用较为普遍的动物源胰酶与链霉菌属(Streptomyces)胰蛋白酶的理论比较，链霉菌源胰蛋白酶的酶活性质和作用方式均与动物源胰蛋白酶相同，而经过链霉菌胰蛋白酶氨基酸序列和胰蛋白酶基因结构的比较，发现链霉菌源胰蛋白酶的氨基酸序列和基因结构同动物源胰蛋白酶具有高度同源性，氨基酸序列相似度80.9%，酶基因序列相似度79.8%。然而，链霉菌源胰蛋白酶的生产却由于链霉菌的发酵周期长，野生菌表达酶活低，及胰蛋白酶基因表达调控复杂等因素而受到制约。

对于动物源胰蛋白酶的重组基因工程菌的构建和表达研究较多，但是由于通过原核生物表达真核生物蛋白在转录和翻译的调节上存在差异，因此得到外源表达胰蛋白酶多数为包涵体蛋白，小鼠的胰蛋白酶编码基因同细菌碱性磷酸酶启动子(phoA)在E.coli中进行融合表达，并且通过添加外源激酶激活胰蛋白酶原，实现了胰蛋白酶的外源表达，但是需要添加外源激酶激活，且产量较低，而链霉菌胰蛋白酶的活性表现不需要添加任何外源激酶，对于链霉菌胰蛋白酶的研究起始较早，但是其集中在酶学性质和生理生化特性方面的研究。对于链霉菌的胰蛋白酶的外源表达研究则主要集中在胰蛋白酶在不同的链霉菌宿主中表达的生理生化作用的研究，且链霉菌的发酵周期普遍较长，发酵控制等相对较为困难，并且链霉菌本身具有的蛋白质水解功能也会影响目的蛋白酶的产量。然而胰蛋白酶在实际应用中的作用温度通常为37℃，在此条件下，胰蛋白酶具有较高的酶催化效率，但会由于热力因素导致其缓慢失活，而导致其效力下降。而目前针对胰蛋白酶的热稳定性改造尚未有报道，但是近些年国内外有较多的N端融合短肽来改善酶热稳定性的报道，比如在酶的N端融合双亲短肽可以明显提高RNaseHI的热稳定性。据此，对链霉菌胰蛋白酶进行重组改造，通过融合人工设计双亲短肽来实现链霉菌胰蛋白酶的热稳定性改造，并且进行热稳定性提高的重组链霉菌胰蛋白酶基因工程菌的构建，来实现链霉菌胰蛋白酶的外源表达，及提高重组菌胰蛋白酶的表达量。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种产热稳定性重组胰蛋白酶（thermostable trypsin，EC3.4.21.4）的酵母工程菌，表达热稳定性提高的的重组胰蛋白酶编码基因(Exmt)。

所述热稳定性提高的胰蛋白酶（thermostable trypsin）基因（Exmt）的序列为SEQ ID NO:1所示。

本发明要解决的另一个技术问题是提供一种类胰蛋白酶酵母工程菌的构建方法。

为解决上述技术问题，所采用的技术方案包括如下具体步骤，见图1：

第一步热稳定性提高的胰蛋白酶基因的获得及分析