[发明专利]表达人血清白蛋白的质粒和重组菌以及它们的应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种表达人血清白蛋白的质粒和重组菌以及它们的应用。

背景技术

天然人血清白蛋白(human serum albumin，HSA)在肝脏中由肝实质细胞合成，在血浆中的半寿期约为15-19天，是非糖蛋白，等电点(PI)为4.7。人血清白蛋白是由585个氨基酸组成的单链蛋白质，分子量为66.5kDa，为由α-螺旋组成的心形分子，包含三个结构域(1-195AA的结构域I、196-383A的结构域Ⅱ、384-585A的结构域Ⅲ)。

通过比对不同来源的白蛋白氨基酸序列发现，白蛋白中Gys位置十分保守，这就决定了它的三维结构的保守性。此外，白蛋白分子会因结合的分子大小不同，环境条件不同而使形状有所变化。在非变性条件下，白蛋白分子内部的二硫键又会使其恢复原状，所以白蛋白具有良好的弹性。

人血清白蛋白是血液系统的重要组成部分，其独特的三级空间结构，使其拥有了结合、运输内源性和外源性物质，维持血液胶体渗透压，清除自由基，抑制血小板功能，抗凝血及影响血管渗透性等多样的生化特性，成为现代医学中十分重要的生物制品。据统计，在美国有38%的白蛋白被用作治疗急性血容量减少以及其他原因造成的血容量减少等。另外，人血清白蛋白还可以抑制多核细胞产生自由基，对自由基进行清除，维持体系统的正常秩序。它还是许多内源性和外援性物质的重要载体，临床上广泛应用于高胆红素血症(新生儿)、白细胞增多症、人血清白蛋白过少症、以及呼吸窘迫综合征等多种疾病的治疗。因此，人血清白蛋白也逐渐成为了临床用量最大的蛋白制剂。

血浆来源的人血清白蛋白给人类带了各种疾病传播的危险，尤其是HIV、HBV病毒，为疾病的治疗带来了不安全的因素。而从生物工程和基因重组技术为基点出发得到的人血清白蛋白就在根源上避免了病毒的污染，成为了近年来越来越多的科研工作者的研究目标。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于表达人血清白蛋白的质粒及其应用。

本发明提供的用于表达人血清白蛋白的质粒，包括表达盒甲和表达盒乙；

所述表达盒甲自上游至下游依次包括：序列表的序列3所示的AOX1启动子、人血清白蛋白的编码基因、序列表的序列4所示的CYC1翻译终止子；

所述表达盒乙自上游至下游依次包括：序列表的序列5所示的GAP启动子、所述人血清白蛋白的编码基因、序列表的序列6所示的AOX1翻译终止子；

所述人血清白蛋白为如下（1）或（2）：

（1）由序列表中序列11所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

（2）将序列11的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列11衍生的蛋白质。

所述人血清白蛋白的编码基因为如下1）或2）或3）或4）或5）的DNA分子：

1）编码区如序列表中序列2自5’末端第13至1842位核苷酸所示的DNA分子；

2）序列2自5’末端第7至1842位核苷酸所示的DNA分子；

3）序列表中序列2所示的DNA分子；

4）在严格条件下与1）或2）或3）限定的DNA序列杂交且编码具有相同功能的蛋白的DNA分子；

5）与1）或2）或3）限定的DNA序列具有90%以上同源性且编码具有相同功能的蛋白的DNA分子。

所述严格条件为在0.1×SSPE（或0.1×SSC）、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。

所述用于表达人血清白蛋白的质粒还包括可DNA片段丙；所述DNA片段丙包括序列表的序列7所示的ADE2启动子和序列表的序列8所示的ADE2基因，且由所述ADE2启动子启动所述ADE2基因的表达。

所述DNA片段丙中还可包括序列表的序列9所示的TRP2基因、序列表的序列10所示的氨苄青霉素抗性基因和pUC复制起点。

所述重组质粒的制备方法具体如下：将用限制性内切酶BglII和BamHI双酶切重组质粒pGAGZαA-HSA得到含有所述表达盒乙的片段（约2.8kb的片段）插入重组质粒pPink-HC-HSA的BamHI酶切位点，得到所述重组质粒（重组质粒pPGH-HX02）；

所述重组质粒pPink-HC-HSA为在pPink-HC载体的EcoRI和KpnI酶切位点之间插入序列表的序列2自5’末端第7-1842位核苷酸所示的双链DNA分子得到的重组质粒；