[发明专利]便利连接基因的植物表达载体及其构建方法与应用

权利要求书

1.一种植物表达载体，其特征在于按照包括如下步骤的方法得到：出发表达载体为pGreenII0229和pCAMBIA3300-35S-HAK，分别用引物从pGreenII0229上克隆两个片段，分别含有LB和RB，且在这两个片段上含有了大肠杆菌中的复制元件；从pCAMBIA3300-35S-HAK上克隆35S-NOS片段；从pGH-X6145G上克隆多克隆位点片段为4#片段；从pCAMBIA2300上克隆35S片段，最后将这5个片段连接在一起，构建成新的植物表达载体pJWWD-1718；

其中，RB位于从pGreenII0229克隆的1#片段5’端下游，LB位于从pGreenII0229克隆的2#片段中部；

其中，所述1#片段如序列SEQ ID NO：1所示，所述2#片段如序列SEQ ID NO：2所示，所述3#片段如序列SEQ ID NO：3所示，5#片段如序列SEQ ID NO：9所示；

其中，所述RB如序列SEQ ID NO：4所示，所述LB如序列SEQ ID NO：5所示，所述凝血酶基因如序列SEQ ID NO：6所示，所述大豆蛋白肽基因如序列SEQ ID NO：7所示。

2.一种植物表达载体，其特征在于按照包括如下步骤的方法得到：

（1）用1#F引物和1#R引物克隆pGreenII0229的1#片段，两端分别带有Not I和MIU I的酶切位点，切胶回收2kb片段；用2#F引物和2#R引物克隆pGreenII0229的2#片段，两端也分别带有Not I和MIU I的酶切位点，切胶回收1600b片段；

（2）用Not I和MIU I酶切回收的1#和2#片段，连接这两个片段，得到载体pJWWD-12；

（3）用3#F引物和3#R引物克隆pCAMBIA3300-35S-HAK上的3#片段，切胶回收3#片段，两端带有Xho I酶切位点；

（4）用Xho I分别酶切pJWW-12和3#片段，连接切开的载体和3#片段，得到载体pJWWD-123；

（5）用4#F引物和4#R引物从pGH-X6145G克隆4#片段，其中含有多克隆位点，切胶回收300bp片段；

（6）用Sac I分别酶切载体pJWWD-123和4#片段，连接切开的载体和4#片段，得到载体pJWWD-1234；

（7）从pCAMBIA2300上克隆35S启动子（5#片段），切胶回收800bp片段；

（8）用Pst I分别酶切载体pJWWD-1234和5#片段并回收，连接切开的载体和5#片段得到载体pJWWD-1718。

3.权利要求1或2所述的表达载体在大肠杆菌转化中的应用。

4.权利要求1或2所述的表达载体在农杆菌介导的植物遗传转化中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述植物为单子叶和双子叶植物，包括：水稻、玉米、大麦、小麦、高粱、甘蔗、美人蕉、白玉兰、大豆、花生、苹果、菊花、棉花、向日葵。

6.权利要求1或2所述表达载体在植物育种中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述的植物为单子叶和双子叶植物，包括：水稻、玉米、大麦、小麦、高粱、甘蔗、美人蕉、白玉兰、大豆、花生、苹果、菊花、棉花、向日葵。