[发明专利]便利连接基因的植物表达载体及其构建方法与应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种植物表达载体及其构建方法，具体为便利连接基因的植物表达载体及其构建方法与应用。 

背景技术

20世纪以来，通过转基因技术培育植物新品种，从而提高产量和抗逆性能，被认为是一种对植物定向改造有效的途径。目前，转基因棉花、大豆、玉米、油菜等已经得到了广泛的种植，为农业种植领域带来革命性的改革，也为农业增收带来了新的曙光。 

植物表达载体是外源基因在植物细胞中进行扩增和表达的媒介，所以也称作工程载体。但在科学研究中构建一种高效的植物表达载体并非易事。中间需要经过质粒载体和连接片段的双酶切、纯化、连接、转化、验证等一系列步骤，费时费力。 

鉴于TA克隆载体的连接模式，我们构建了这种便利连接目的基因的新型植物表达载体。在操作过程中只要选用Taq-Plus酶使目的片段的PCR产物末端带有游离的腺嘌呤A就可以直接用来做连接反应，省去了连接片段酶切、回收、纯化等一系列中间步骤，大大提高了我们实验的效率。 

在提高连接效率的基础上，我们还考虑到转基因生物安全性的问题。通常使用的植物表达载体携带有编码抗生素的抗性基因，用于构建载体过程中进行筛选，同时可以在转入植物后对转化植株进行筛选。当转化植株被筛选出来后，这些抗生素抗性基因在基因组中的存在就显得没有意义了，并且它们会随着转基因植物的繁殖而遗传给子代，从而引发有关转基因植物安全的许多问题。 

为了在转基因农作物中得到广泛应用，载体中不能含有抗生素抗性基因，因而用抗除草剂基因（bar）作为转化植株的筛选基因，可以有效避免抗生素抗性基因给人和牲畜健康带来的危害。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种便利连接基因的植物表达载体及其构建方法与应用。本发明载体可以方便快捷插入目的基因，目的基因可通过简单的TA克隆连接入载体，大大简化了操作步骤，降低了成本，提高了工作效率。该载体的发明可为植物基因工程育种提供有力支持，并为转基因植物的安全性评价和商业化种植奠定基础。 

本发明所提供的植物表达载体按照如下步骤得到：出发的原始表达载体为pGreenII0229，pCAMBIA2300，pCAMBIA3300-35S-HAK，pGH-X6145G上（购自上海生工），分别用引物从pGreenII0229上克隆两个片段，分别含有LB和RB（RB位于从pGreenII0229克隆的1#片段5’端下游，LB位于从pGreenII0229克隆的2#片段中部），且在这两个片段上含有了大肠杆菌中的复制元件；从pCAMBIA3300-35S-HAK上克隆35S-NOS片段（3#片段）；从pGH-X6145G上克隆多克隆位点片段（4#片段）；从pCAMBIA2300（实验室保存）上克隆35S启动子（5#片段）最后将这5个片段连接在一起，构建成新的植物表达载体pJWWD-1718，新构建的载体上作为载体标签的是凝血酶基因和大豆蛋白肽基因。 

其中，所述1#片段序列如序列SEQ ID NO：1所示，所述2#片段序列如序列SEQ ID NO：2所示，所述3#片段序列如序列SEQ ID NO：3所示。 

其中，所述RB序列如序列SEQ ID NO：4所示，所述LB序列如序列SEQ ID NO：5所示，所述凝血酶基因（thrombin）序列如序列SEQ ID NO：6所示，所述大豆蛋白肽基因（soybean peptide）序列如序列SEQ ID NO：7所示。连接4#片段测序结果如序列SEQ ID NO：8所示，所述5#片段序列如序列SEQ ID NO：9所示。 

专利中所用pGreenII0229，pCAMBIA3300，pCAMBIA2300均从CAMBIA公司购买，pCAMBIA3300-35S-HAK为本实验室构建（《HAK基因对玉米的遗传转化及其耐盐性研究》），凝血酶基因和大豆蛋白肽为公开的序列，具体可参考文献：Sequence of a human transcript expressed in T-lymphocytes and encoding a fibrinogen-like protein和A novel methionine-rich protein from soybean cotyledon: cloning and characterization of cDNA (accession no. AF005030)。 

本发明所构建的植物表达载体，还可以按照包括如下步骤得到：