[发明专利]基质金属蛋白酶抑制剂多肽及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及药物领域，具体涉及具有抑制基质金属蛋白酶和具有包括抑制血管内皮细胞迁移在内的血管生成抑制剂，可用于血管相关疾病包括肿瘤和类风湿在内的疾病治疗。 

背景技术

近年我国肿瘤的发病率和病死率不断增长。无限制生长、侵袭和转移是肿瘤的恶性标志和特征，也是导致治疗失败和死亡的主要原因。因此，控制肿瘤的生长、侵袭和转移是改善预后，提高生存率的主要措施。1971年Folkman首先提出肿瘤生长依赖血管新生的理论，肿瘤血管生成是肿瘤生长和转移的形态学基础，它不仅向肿瘤提供营养，也向宿主输出大量的肿瘤细胞导致肿瘤的生长和转移。绝大多数恶性实体肿瘤如卵巢癌、肝癌、宫颈癌和乳腺癌等都是血管依赖性肿瘤。新生血管一方面为肿瘤生长提供营养和氧气，另一方面还是肿瘤转移的重要途径。因此，抑制肿瘤血管形成是重要的抗癌措施。 

基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)是一组结构相似和功能相关的蛋白内切酶。它们可以切割各种细胞外基质，为炎症细胞和肿瘤细胞的转移打开“通路”；它们可以切割细胞因子或趋化因子，影响炎症细胞的募集；它们还可以切割各种膜连接分子，包括受体和细胞间连接分子，从而调节这些分子的功能。 

基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)是基质金属蛋白酶的典型代表，它的结构复杂、功能多样并且是一种诱导表达的酶。研究发现，MMP-9可以在几个方面促进肿瘤生长。首先，MMP-9是肿瘤部位血管增生的“开关”，它可以切割细胞外基质，释放连接于基质上的VEGF，促进血管增生，血管增生是肿瘤生长的前提条件。这一点可由MMP-9基因敲除小鼠抑制肿瘤部位血管增生得到证明。MMP-9还可以通过从细胞外基质释放VEGF的方式促进淋巴管增生，促进肿瘤转移。其次，肿瘤细胞以及进入肿瘤组织的巨噬细胞和T细胞表面都表达有TNF-α前体，几种金属蛋白酶（包括MMP-9）可以切割并释放有活性的TNF-α，促进血管增生和抑制肿瘤细胞的凋亡。另外，肿瘤部位的炎症细胞 表达的MMP-9可以通过两个方面激活TGF-β途径，一是把TGF-β前体切割成有活性的TGF-β,二是切割TGF-β连接蛋白，把TGF-β从细胞外基质上释放出来，活化的TGF-β抑制免疫系统，却不抑制肿瘤本身的生长，从而间接的促进肿瘤生长。 

MMP抑制剂不但可抑制肿瘤的生长和转移，还具有靶向功能，早在1999年，Koivunen就发现表达了MMP-9多肽抑制剂序列的噬菌体可富集于肿瘤部位。Schafers用MMP-9抑制剂将¹²³I带到肿瘤组织中的MMP-2和MMP-9高表达部位。在最近的研究中，用荧光探针标记的多肽片段（MMP的多肽底物）可以把肿瘤部位的MMP-2，MMP-9和MMP-14的活力定位于转移细胞的前端（已经做到亚细胞定位）。以上的例子表明MMP抑制剂具有靶向功能，不但可早期检测到肿瘤组织，还可以把目的物带到肿瘤部位。MMP-9多肽抑制剂的优势在于，其序列可以连接到其它有抗肿瘤活性的多肽或蛋白质上，新的分子不但可以抑制MMP-9活力，还可以通过MMP-9多肽抑制剂部分把有抗肿瘤活性的成分富集于肿瘤部位，提高其抗肿瘤效果。 

内皮抑素是一种内源性血管增生抑制剂，但其分子中含有多个二硫键，作为基因工程表达产品，其生产工艺难于控制，影响到产物活性的发挥。发现内皮抑素的50-60个氨基酸(ES-2)在体外具有很好的抑制血管生成的活性，甚至高于内皮抑素本身的活性。Xu小组研究发现ES-2在鸡胚尿囊膜（CAM）实验中抑制血管增生活性很高，但在小鼠移植肿瘤模型给药中并无此活性。这可能是因为体内实验中ES-2不能在肿瘤部位形成有效浓度。 

基于这些研究结果，本实验室将MMP-9多肽抑制剂连接于ES-2的N端或C端，获得新的多肽。新多肽可以直接抑制MMP-9的活力，抑制肿瘤生长和转移；还可以把ES-2富集于肿瘤部位，增加其在肿瘤部位有效浓度，增强其抗肿瘤活性。根据这个思路设计的多肽在C57Bl/6小鼠上显著的抑制了黑色素瘤B16F10的生长，证明了设计思路的正确性和可行性。