[发明专利]一种大白菜SSR指纹图谱构建方法

权利要求书

1.一种大白菜SSR指纹图谱构建方法，包括提取供试品种DNA、用荧光标记SSR引物进行PCR扩增、电泳检测和指纹图谱构建，其特征在于：所述的荧光标记SSR引物包括29对核心SSR引物，分别是cnu_m139a、nia_m086a、nia_m098a、nia_m138a、cnu_m046a、nia_m121a、cnu_m073a、cnu_m288a、cnu_m316a、cnu_m327a、nia_m101a、cnu_m252a、Na10-D09、cnu_m289a、cnu_m442a、cnu_m050a、cnu_m149a、nia_m037a、nia_m049a、cnu_m182a、cnu_m295a、cnu_m090a、cnu_m016a、cnu_m530a、cnu_m534a、nia_m038a、nia_m022a、ENA2、nia_m035a，其核苷酸序列依次如序列表SEQ ID No.1～58所示；所述电泳检测为五色荧光毛细管电泳检测或者变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。

2.如权利要求1所述的一种大白菜SSR指纹图谱构建方法，其特征是，所述电泳检测为五色荧光毛细管电泳检测，具体为：将6-FAM和HEX荧光标记的PCR产物用超纯水稀释30倍，TAMRA和ROX荧光标记的PCR产物用超纯水稀释10倍；分别取等体积的上述4种稀释后溶液混合形成混合液；取1μL混合液加入0.1μL LIZ500分子量内标和8.9μL去离子甲酰胺加入到DNA分析仪专用深孔板孔中；然后将其在PCR仪上95℃变性5min，取出，立即置于碎冰上，冷却10min以上；瞬时离心10s后置放到DNA分析仪上进行毛细管电泳检测，用GENEMAPPER进行图像分析和数据采集；将每一位点待测样品和相应的参照品种扩增片段的带型和移动位置进行比较，根据参照品种的移动位置和扩增片段大小，确定待测样品该位点的等位变异大小，纯合位点的等位变异记录为X/X，杂合位点的等位变异记录为X/Y，多个位点的数据整合在一起形成不同大白菜品种的SSR指纹图谱。

3.如权利要求1所述的一种大白菜SSR指纹图谱构建方法，其特征是，所述电泳检测为变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，具体为：采用6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测PCR扩增产物，60W恒功率电泳1.5h，银染显色；以pBR322DNA/MspI为DNA分子量标准，将每一位点待测样品和相应的参照品种扩增片段的带型和移动位置进行比较，根据参照品种的移动位置和扩增片段大小，确定待测样品该位点的等位变异大小，纯合位点的等位变异记录为X/X，杂合位点的等位变异记录为X/Y；多个位点的数据整合在一起形成不同大白菜品种的SSR指纹图谱。

4.如权利要求2或3所述的一种大白菜SSR指纹图谱构建方法，其特征是，用29对核心SSR引物分别对供试品种DNA进行PCR扩增采用25μL的反应体积，该反应体系含dNTP0.25mmol/L，正向引物、反向引物各0.4μmol/L，Taq DNA聚合酶1.0单位，1×PCR缓冲液，MgCl₂1.5mmol/L，样品DNA10-40ng；反应程序采用TouchdownPCR：94℃预变性4min；94℃变性45s，65℃退火45s，72℃延伸45s，每循环降1℃，共15个循环；94℃变性45s，50℃退火30s，72℃延伸45s，共30个循环；72℃延伸10min，4℃保存；所述1×PCR缓冲液不含Mg²⁺。

5.采用权利要求2或3的方法所构建的大白菜SSR指纹图谱。

6.一种利用权利要求5所述的大白菜SSR指纹图谱进行大白菜品种鉴定的方法，其特征是，依据29对核心荧光标记SSR引物的检测结果进行判定：品种间差异位点数≥3为不同品种；品种间差异位点数<3为近似品种。