[发明专利]一种大白菜SSR指纹图谱构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种大白菜SSR指纹图谱构建方法，属于农业的大白菜育种与应用技术领域。

背景技术

大白菜（B.campestris L.ssp.Pekinensis(Lour).Olsson，染色体组AA，2n=2x=20）起源于中国，是最具中国特色、分布最广、种植面积最大的重要蔬菜作物。大白菜在中国的种植面积约占蔬菜播种面积的9%～15%，并且先后传入日本、韩国、朝鲜等国家。由于大白菜在中国及东亚国家的蔬菜生产和消费中占有举足轻重的地位，因此对商用种子品种的鉴别尤为重要。

目前我国对大白菜品种进行鉴定主要方法是按照GB/T 19557.5-2004《植物新品种特异性、一致性和稳定性测试指南大白菜》进行田间测定来鉴定的。这种方法存在的主要问题是运用田间测定，鉴定结果易受环境因素的影响，也常出现不同测试人员对某些性状的认识存在偏差，导致代码判定结果不一致的问题。同时田间测定周期长，不能及时、快捷地为新品种侵权案件提供鉴定依据。测试性状多、工作量大，无法适用大量品种的测试需求。

利用分子标记技术建立DNA指纹图谱（fingerprint）是鉴别品种、品系的有力工具。品种DNA指纹数据库的构建在白菜品种纯度及真实性鉴定、品种权登记保护、区试及审定品种质量监控等方面具有重要应用价值，对理清我国白菜种质的亲缘关系、杂种优势群划分、种质创新及新品种选育具有重要指导意义。目前用于绘制植物DNA指纹图谱的标记技术主要有RAPD、RFLP、AFLP、SSR等。简单重复序列（Simple sequence repeat,SSR）也叫微卫星（Microsatellites），是第二代基于PCR技术的分子标记技术。与其它分子标记相比，SSR标记具有多态信息含量高、共显性遗传、技术简单、重复性好、特异性强等特点，已被广泛应用于植物遗传研究和育种实践中。目前，SSR标记也已经应用于大白菜、水稻、小麦、大麦、玉米等作物的指纹图谱构建、品种鉴定和遗传多样性分析。

发明内容

本发明的目的在于：针对目前大白菜品种的鉴定只能在大田里进行，易受环境影响且工作量大等一系列问题，提供一种大白菜SSR指纹图谱构建方法，利用SSR指纹图谱进行品种鉴定。

本发明的目的是这样实现的：一种大白菜SSR指纹图谱构建方法，包括提取供试品种DNA、用荧光标记SSR引物进行PCR扩增，电泳检测和指纹图谱构建，其特征在于：所述的荧光标记SSR引物包括29对核心SSR引物，分别是cnu_m139a、nia_m086a、nia_m098a、nia_m138a、cnu_m046a、nia_m121a、cnu_m073a、cnu_m288a、cnu_m316a、cnu_m327a、nia_m101a、cnu_m252a、Na10-D09、cnu_m289a、cnu_m442a、cnu_m050a、cnu_m149a、nia_m037a、nia_m049a、cnu_m182a、cnu_m295a、cnu_m090a、cnu_m016a、cnu_m530a、cnu_m534a、nia_m038a、nia_m022a、ENA2、nia_m035a，其核苷酸序列依次如序列表SEQ ID No.1～58所示。

具体步骤如下：

（1）提取供试品种的DNA；

（2）用29对核心SSR引物分别对供试品种DNA进行PCR扩增。PCR扩增采用25μL的反应体积，含dNTP 0.25mmol/L，正向引物、反向引物各0.4μmol/L，Taq DNA聚合酶1.0单位，1×PCR缓冲液（不含Mg²⁺），MgCl₂1.5mmol/L，样品DNA 10-40ng。反应程序采用TouchdownPCR：94℃预变性4min；94℃变性45s，65℃退火45s，72℃延伸45s，每循环降1℃，共15个循环；94℃变性45s，50℃退火30s，72℃延伸45s，共30个循环；72℃延伸10min，4℃保存。

（3）PCR产物经电泳检测构建大白菜品种的SSR指纹图谱。

a.变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测