[发明专利]鲤鱼糖转运载体蛋白Sglt1兔抗血清的制备方法无效
申请号: | 201310084523.4 | 申请日: | 2013-03-18 |
公开(公告)号: | CN103204932A | 公开(公告)日: | 2013-07-17 |
发明(设计)人: | 聂国兴;张建新;王俊丽;侯彩霞;闫潇;张新胜 | 申请(专利权)人: | 河南师范大学 |
主分类号: | C07K16/18 | 分类号: | C07K16/18;C07K16/06 |
代理公司: | 新乡市平原专利有限责任公司 41107 | 代理人: | 于兆惠 |
地址: | 453007 *** | 国省代码: | 河南;41 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 鲤鱼 转运 载体 蛋白 sglt1 血清 制备 方法 | ||
1.鲤鱼糖转运载体蛋白Sglt1兔抗血清的制备方法,其特征在于包括以下步骤:(1)克隆鲤鱼肠道糖转运载体蛋白Sglt1的基因,通过分析膜蛋白Sglt1的三维结构、跨膜区和抗原决定簇,利用原核表达具有抗原决定簇的部分Sglt1基因片段作为免疫抗原蛋白代替表达全长基因;(2)构建糖转运载体蛋白Sglt1的基因工程菌;(3)糖转运载体蛋白Sglt1基因工程菌的诱导表达与鉴定;(4)制备糖转运载体蛋白Sglt1抗原;(5)免疫兔子;(6)采血样测定鲤鱼肠道糖转运载体蛋白Sglt1的效价;(7)颈动脉采血制备糖转运载体蛋白Sglt1的兔抗血清;(8)免疫组织化学方法检测。
2.根据权利要求1所述的鲤鱼糖转运载体蛋白Sglt1兔抗血清的制备方法,其特征在于所述的步骤(4)中制备糖转运载体蛋白Sglt1抗原的具体步骤为:将步骤(3)诱导表达的菌液离心,弃上清,按照湿重1 g的菌体加6 ml的蒸馏水,吹打混匀,再加入与上述菌体混合液等体积的2×SDS-PAGE上样缓冲液,混匀,沸水浴10 min,使蛋白变性,进行SDS-PAGE电泳,电泳结束后将分离胶放于0.3 M KCl溶液里染色,显示目的条带,切下分离胶上的目的蛋白条带,放入ddH2O里清洗,将胶条剪碎放入塑料培养皿中,冷冻干燥1 d,放入研钵中磨成粉末,每200 mg目的蛋白粉加3 ml生理盐水溶解蛋白,离心,取上清,用超微量分光光度计检测蛋白浓度。
3.根据权利要求1所述的鲤鱼糖转运载体蛋白Sglt1兔抗血清的制备方法,其特征在于所述的步骤(5)中免疫兔子的具体步骤为:按注射要求将蛋白溶液稀释;乳化:耳缘静脉注射:0.8 ml蛋白溶液+0.4 ml完全弗氏佐剂或不完全弗氏佐剂,漩涡震荡,皮内注射:1 ml蛋白溶液+1 ml不完全弗氏佐剂,漩涡震荡;注射方法:第一、二次采用耳缘静脉注射法,第三、四次采用皮内多点注射法;每隔10 d加强免疫1次,第1次免疫加完全弗氏佐剂,以后加强免疫时用不完全弗氏佐剂。
4.根据权利要求1所述的鲤鱼糖转运载体蛋白Sglt1兔抗血清的制备方法,其特征在于所述的步骤(7)中颈动脉采血制备糖转运载体蛋白Sglt1的兔抗血清的具体步骤为:步骤(5)中第四次免疫后8 d颈动脉采血,兔子在采血前禁食1 d,采集血样收集于经灭菌并不含抗凝剂的离心管中,室温放置2 h,待血液凝块后,4 ℃保存使之凝固,析出淡黄色抗血清,将抗血清转移至另一管中,血凝块以1500 rpm离心10 min,吸出上清液合并于收集到的抗血清管中,分装冷冻干燥保存,部分放于4 ℃备用。
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