[发明专利]鲤鱼糖转运载体蛋白Sglt1兔抗血清的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物制品技术领域，具体涉及鲤鱼糖转运载体蛋白Sglt1兔抗血清的制备方法。

背景技术

鲤鱼（Cyprinus carpio），又称鲤拐子、鲤子，隶属于鱼纲，鲤形目，鲤科。其种类多，有红鲤、团鲤、草鲤、荷色鲤、锦鲤、火鲤、芙蓉鲤、荷包鲤等。鲤鱼对水体环境适应性强，是我国淡水养殖传统的优良品种。

鲤鱼肠上皮细胞刷状缘膜上的钠/葡萄糖共转运载体（Na⁺/glucose cotransporter，Sglt1）是协助葡萄糖跨膜吸收的主要蛋白，在动物的生命活动中具有重要意义。Sglt1载体蛋白结合1 mol葡萄糖和2 mol钠离子，形成Na⁺-载体-葡萄糖复合物，顺Na⁺浓度梯度进入细胞，随后由位于基底膜的葡萄糖易化转运载体2（Glut2）将葡萄糖协助转运至血液。

为了研究sglt1基因表达和转运活性的调控因素及调控机理，需要高特异性的Sglt1抗体。Sglt1抗体可为Sglt1的组织定位、细胞定位、表达定量、鱼类糖代谢障碍等系列研究奠定物质基础。获得大量有活性的Sglt1蛋白作为免疫抗原是制备高活性抗体的关键。由于鲤鱼Sglt1蛋白是典型的跨膜蛋白，组织含量低，具有14个跨膜域，且其N端和C端位于胞外一侧，因此，不能有效地分离纯化及体外表达超量具有生物活性的Sglt1抗原蛋白成了制备Sglt1抗体的瓶颈。

与本发明相关的现有技术一的技术方案是通过蛋白质分离纯化的方法，从组织中直接分离纯化Sglt1蛋白作免疫抗原。其缺点是细胞内蛋白一般含量很低，提取方法复杂，得到的蛋白量相对较少，含杂质多，需要复杂的纯化过程，成本高。与本发明相关的现有技术二的技术方案是通过构建工程菌体外表达外源蛋白作免疫抗原。其缺点是通过构建原核或真核表达系统来表达抗原蛋白，虽然体外表达的效率和表达量比较高，但是这种方法有很多的局限性，很多特殊结构异源基因如富含AT碱基和一些跨膜蛋白的基因很难在微生物中表达或者表达量很低，有的即使表达了但是没有活性。与本发明相关的现有技术三的技术方案是通过无细胞表达系统表达外源蛋白，无细胞表达系统是指以细胞裂解液为基础，加之外援的RNA模板、氨基酸和能量所构成的细胞外表达体系。其缺点是无细胞表达系统可以表达一些跨膜蛋白，但是这项技术在国内外还处于实验室研究水平，技术难度大，成本高，目前还无法实际应用。

国内外已经完成了对鲤鱼Sglt1全长的测序工作，包括5′端非翻译区（5′UTR），3′端非翻译区（3′UTR），一个2000bp左右的开放阅读框（ORF）。经序列同源性分析显示，Sglt1氨基酸序列具有高度保守性，鲤鱼Sglt1氨基酸序列和斑马鱼的相似性最高达90%以上，与兔子的Sglt1氨基酸序列相似性最低（低于70%）。鲤鱼肠道sglt1基因全长1977 bp，其Sglt1蛋白具有14个跨膜域，所以重组表达sglt1基因全长存在一定的困难。

发明内容

本发明解决的技术问题是提供了一种鲤鱼糖转运载体蛋白Sglt1兔抗血清的制备方法。

本发明的技术方案是：鲤鱼糖转运载体蛋白Sglt1兔抗血清的制备方法，其特征在于包括以下步骤：（1）克隆鲤鱼肠道糖转运载体蛋白Sglt1的基因，通过分析膜蛋白Sglt1的三维结构、跨膜区和抗原决定簇，利用原核表达具有抗原决定簇的部分Sglt1基因片段作为免疫抗原蛋白代替表达全长基因；（2）构建糖转运载体蛋白Sglt1的基因工程菌；（3）糖转运载体蛋白Sglt1基因工程菌的诱导表达与鉴定；（4）制备糖转运载体蛋白Sglt1抗原；（5）免疫兔子；（6）采血样测定鲤鱼肠道糖转运载体蛋白Sglt1的效价；（7）颈动脉采血制备糖转运载体蛋白Sglt1的兔抗血清；（8）免疫组织化学方法检测。

本发明所述的制备糖转运载体蛋白Sglt1抗原的具体步骤为：将步骤（3）诱导表达的菌液离心，弃上清，按照湿重1 g的菌体加6 ml蒸馏水，吹打混匀，再加入与上述菌体混合液等体积的2×SDS-PAGE上样缓冲液，混匀，沸水浴10 min，使蛋白变性，进行SDS-PAGE电泳，电泳结束后将分离胶放于0.3 M KCl溶液里染色，显示目的条带，切下分离胶上的目的蛋白条带，放入ddH₂O里清洗，将胶条剪碎放入塑料培养皿中，冷冻干燥1 d，放入研钵中磨成粉末，每200 mg目的蛋白粉加3 ml生理盐水溶解蛋白，离心，取上清，用超微量分光光度计检测蛋白浓度。