[发明专利]电转染的方法及设备

说明书

技术领域

本发明涉及转基因的方法和设备，特别适合但不仅限于对原代淋巴细胞转基因中的电转染的方法及设备。

背景技术

肿瘤免疫治疗领域中，采用转基因技术设计靶向肿瘤细胞的效应T淋巴细胞是很有前景的免疫治疗新方法。同种异体骨髓的干细胞移植成功和向高度恶性血液癌症患者输注淋巴细胞的临床案例表明，人体免疫系统可以控制甚至消灭残余病灶。输入外源淋巴细胞的主要并发症是移植物抗宿主反应，除了攻击肿瘤细胞也要攻击正常细胞。由于自体免疫系统的耐受机制，自体淋巴细胞不包含高亲和力效应细胞，通过转基因技术使自体淋巴细胞具有靶向肿瘤抗原并杀伤肿瘤细胞成为肿瘤免疫治疗的新方向。

筛选和克隆出针对肿瘤抗原的特异性T细胞受体，通过转基因技术把该T细胞受体转入患者外周血T淋巴细胞，然后扩增和激活，回输患者体内，具有靶向性的T淋巴细胞就能杀伤肿瘤细胞，同时又不会杀伤正常组织细胞。尤其对发生转移和产生化疗药物抵制的肿瘤干细胞采用过继性T淋巴细胞治疗能取得好的效果，这弥补了手术和化疗手段治疗肿瘤干细胞的不足。

到目前为止，肿瘤免疫治疗中使用过继性转基因T细胞，都采用逆转录病毒载体才能产生有效的稳定的治疗效果，这也导致一些安全隐患。第一：由于转录病毒载体存在随机插入整合的问题，会对患者自体细胞造成不可逆的遗传操作，有产生癌变的潜在风险；第二：目前嵌合抗原受体T细胞一般是用反转录或者慢病毒转染的外周血T淋巴细胞，在体外筛选并扩增出稳定表达细胞，当治疗完成或者出现副作用时如何清除掉这些转基因T细胞成为一个后患问题；第三：病毒载体转基因技术在操作上繁琐，会导致产生质量管理与控制的不利因素问题。安全问题成为病毒载体转基因的固有缺陷。

非病毒载体转基因方法中最引人关注的是电转染技术，根据clinicaltrials.gov统计显示，到目前为止共有35个电转染的临床试验。电转染DNA疫苗，皮下肌肉注射疫苗并辅以电转染的临床试验有19例，其中结肠癌疫苗1例，前列腺癌疫苗1例，H5N1禽流感病毒DNA疫苗2例，黑色素瘤DNA疫苗2例，HIV疫苗5例，乳头瘤病毒DNA疫苗2例，宫颈上皮内瘤DNA疫苗1例，慢性丙型肝炎疫苗2例，血液恶性肿瘤疫苗1例，抗恶性疟原虫DNA疫苗1例，晚期癌症肿瘤疫苗1例。

电转染细胞因子质粒，在瘤内注射细胞因子质粒并辅以电转染的临床试验有3例，转移性黑色素瘤内注射并电转IL2质粒2例，恶性黑色素瘤内注射并电转IL12质粒1例。

电转染化疗药物，对顽固性、皮肤鳞状、胶质状肿瘤注射博莱霉素并辅以电转染的临床试验有9例，其中头颈癌注射电转博莱霉素2例，皮肤及皮下肿瘤注射电转博莱霉素1例，胰腺癌电转博莱霉素1例，黑色素瘤电转博莱霉素1例，直肠癌电转博莱霉素1例，脑转移肿瘤电转博莱霉素1例，电转博莱霉素治疗肿瘤皮肤溃疡转移1例，电转博莱霉素治疗复发乳腺癌1例。

电转染的其它临床试验包括电转染安全与耐受性测试2例，不可逆电穿孔治疗早期原发性肝癌1例。

以上统计数据显示电转染技术还没有用于原代淋巴细胞的转基因治疗，原因是以下四点：

首先，现有的电转染技术采用电容单次放电形成高压电场。如图1所示现有电转染仪的电路原理示意图，电路包含一个充电回路和一个放电回路。当开关K1导通时，控制电路向电容C充电，待电容充电完成后，断开开关K1。放电时，使K2导通时，电容C向负载放电。整个电路的放电时间是由放电时间RC的值决定，R是放电回路的等效电阻，包括负载电路的电阻，C是电容的容量值，该电路只能产生单次、正向的高压放电脉冲，不能产生低压的放电脉冲。在电容放电中，如果电压低了，不能在细胞膜上有效的形成小孔，如果电压高了，能量过于集中，会在细胞膜上形成永久性穿孔，导致靶细胞死亡。由此表明了电容单次放电容易导致原代淋巴细胞凋亡率升高，进而成功转基因的原代淋巴细胞可得率降低。

其次，现有的电转染技术采用正向脉冲放电，由于细胞内是负电荷，因此正电极附近的细胞转染效率比负电极附近的细胞转染效率高，而且细胞膜穿孔都是面向正电极方向，电转染细胞总数降低和膜穿孔偏少导致转基因原代淋巴细胞可得率降低。

再次，紧接着高压脉冲放电之后，长时间的低电压电泳对提高原代淋巴细胞的电转染效率是必要的，但目前没有这项措施。因为在短暂的高压电场中，细胞膜会形成暂时性小孔，这时施加低电压电流，外源分子被电泳进入细胞质中。