[发明专利]母猪粪便孕激素的酶免测定法及检测母猪发情期的方法

权利要求书

1.一种母猪粪便孕激素的酶免测定法，其特征在于：步骤如下：

1)样品收集：收集母猪粪便并称0.5g溶于20ml测定缓冲液中，离心，取上清，放于4℃待测；

2)竞争ELISA测定样品中孕激素的含量：

A)孕酮抗体包被：用含1∶10000抗体的包被缓冲液包被96孔酶标板，4℃冰箱放置24～48小时，待用；

B)封闭：舍去内容物，封闭缓冲液封闭包被孔，每孔280μl，37℃放置2h；

C)加待测样：取出包被板，舍去内容物，用洗涤液冲洗三次，3分钟/次；然后每孔加入待测样品100ul，再加1∶10000倍的孕酮酶标物工作液，37℃温育2小时以上；

D)显色：用洗涤液冲洗三次，3分钟/次；加入底物液，200ul/孔，37℃避光，放置30分钟以上；

E)终止：加入终止液，终止酶促反应；

F)读取OD_492nm值：用酶标仪在492nm波长处读取各孔的光密度值；

G)OD值到浓度的换算：将标准曲线直线化：设样本孕酮浓度为x，结合率(E/E0：样品孔OD值/零标准孔OD值)为y，可得方程y＝a+blnx，利用回归方程即可求得待测样本的孕酮含量pg/100ul工作液。

2.根据权利要求1所述的母猪粪便孕激素的酶免测定法，其特征在于：所述步骤(1)中的测定缓冲液为pH值为9.6的碳酸盐缓冲液、pH值为7.4的Tris盐酸缓冲液、pH值为7.4的磷酸盐缓冲液或蒸馏水。

3.根据权利要求1所述的母猪粪便孕激素的酶免测定法，其特征在于：所述包被缓冲液的组成为：Na₂CO₃ 0.795g、NaHCO₃ 1.465g、H₂O 500ml。

4.根据权利要求1所述的母猪粪便孕激素的酶免测定法，其特征在于：所述封闭缓冲液的组成为：2.0gBSA加0.05mol/L、pH7.0磷酸盐缓冲液溶解定量至100ml；所述磷酸盐缓冲液的组成为：Na₂HPO₄·12H₂O 10.925g，NaH₂PO₄·2H₂O 3.04g，NaCl 4.35g，H₂O 500ml。

5.根据权利要求1所述的母猪粪便孕激素的酶免测定法，其特征在于：所述洗涤液的组成为：250μl吐温20加0.05mol/L磷酸盐缓冲液1000ml。

6.根据权利要求1所述的母猪粪便孕激素的酶免测定法，其特征在于：所述孕酮酶标物工作液是酶标物洗脱液用稀释缓冲液稀释成1∶10000得到的；

所述酶标物洗脱液是通过以下方法制备得到的：2.2mg孕酮-11α-半琥珀酸酯，1μl N-甲基吗啉，加到含有150μl N，N’-二甲基甲酰胺的反应试管中，冷却到-15℃，然后加入1μl氯甲酸异丁酯，该试液在-15℃反应50min，然后将其以每次10μl的滴加量缓慢滴加到事先冷却到0℃的反应试管中，反应试管中含有浓度为0.5％的NaHCO₃水溶液100μl，以及DMF75μl，其中，NaHCO₃水溶液中溶有10.3mg的辣根过氧化物酶(HRP)，-15℃保持1h，置0℃保持4h；用蒸馏水搅拌透析30min，再用pH7.5的0.1M磷酸盐缓冲液置4℃透析2d，接着通过Sephadex G25过柱层析，所用洗脱液为pH7.5、浓度0.1M的PBS；过柱后，得到黄色洗脱液，用洗脱液调整光密度OD403nm至1.0，即得酶标物洗脱液；

所述稀释缓冲液的组成为：Na₂HPO₄·12H₂O 10.925g，NaH₂PO₄·2H₂O 3.04g，NaCl 4.35g，BSA 0.5g，H₂O 500ml。