[发明专利]母猪粪便孕激素的酶免测定法及检测母猪发情期的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种母猪粪便孕激素的酶免测定法，测定粪便中孕激素浓度以监控母猪卵巢活动，属于生物技术领域。

背景技术

酶联免疫吸附测定法(ELISA)的原理：竞争性ELISA的原理是先将抗体包被于固相，之后加入一定待测样本(含待测抗原)和一定量的酶标抗原结合物，此时它们能竞争性的与固相抗体结合，再经孵育洗涤后加底物显色，测定它们的OD₄₉₂值，根据标准曲线计算出待测物含量。如果样品中孕酮含量高，则包被在固相载体上的大多数孕酮抗体为样品中的游离孕酮结合，此时酶标孕酮结合就相对较少，在洗的时候，结合在包被抗体的孕酮没有被洗，而游离的酶标孕酮被洗，加底物显色，颜色就浅。反之，如果孕酮含量低，酶标孕酮就会与抗体结和，被洗掉的是游离的孕酮，酶标孕酮被固定在板上，加底物显色，颜色深。

运用ELISA方法测定生殖激素监控生殖器官活动在生产中的应用：雌/孕激素的含量变化是卵巢上卵泡、黄体发育的结果，是母畜卵巢功能的体现。母畜周期性发情的实质是卵巢上黄体与卵巢的交替发育并最终体现在雌/孕激素的含量上的变化。因此通过测定雌/孕激素浓度有助于了解卵巢活动状态和卵巢分泌功能，监控动物的繁殖育种能力，对发情鉴定、早期妊娠诊断及卵巢功能诊断有着重要意义。在生产过程中，通常运用ELISA方法对采集的动物血样进行雌/孕激素含量的测定，但这种采样方法会对动物产生一定的应激，并且实施有一定的难度。

由于类固醇激素在动物体内血液中迅速被结合，然后通过不同的途径分泌到尿液和经胆汁排到肠道中，类固醇激素通过与葡萄糖醛酸或硫酸盐结合，形成水溶性的无活性的葡萄糖苷酸或硫酸盐而被排泄到粪便和尿液中。动物尿液中和粪便中雌激素主要由雌酮、17α-雌二醇、17β-雌二醇组成；在粪便中孕酮代谢物主要有5α-孕烷、5β-孕烷，这与血液中的雌激素和孕酮种类基本相同。因此，测定母畜尿液、粪便等方法以代替测定血液监测母畜卵巢及其它生殖器官的活动，此种检测方法采样简单，对动物产生的负面影响小、灵敏度高，特异性好，易于操作检测，并且结果可靠。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的是针对目前利用血液测定动物孕激素含量的方法所存在的不足，如动物应激、伤害、采血难度大等现状，利用竞争性酶免法测定粪便中生殖激素浓度以监控母猪卵巢机能，该方法所需要样品易收集，对动物基本无伤害，测得的结果可靠，能够代替测定动物血液方法监控动物一系列生殖活动。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种母猪粪便孕激素的酶免测定法，步骤如下：

1)样品收集：收集母猪粪便并称0.5g溶于20ml测定缓冲液中，离心(3000转/分，10分钟)，取上清，放于4℃待测；

2)竞争ELISA测定样品中孕激素的含量：

A)孕酮抗体包被：用含1∶10000抗体的包被缓冲液包被96孔酶标板，4℃冰箱放置24小时，待用；

B)封闭：舍去内容物，封闭缓冲液封闭包被孔，每孔280μl，37℃放置2h；

C)加待测样：取出包被板，舍去内容物，用洗涤液冲洗三次，3分钟/次；然后每孔加入待测样品100ul/孔，再加1∶10000倍的孕酮酶标物工作液，37℃温育2小时以上；

D)显色：用洗涤液冲洗三次，3分钟/次；加入底物液，200ul/孔，37℃避光，放置30分钟以上；

E)终止：加入终止液，终止酶促反应；

F)读取OD_492nm值：用酶标仪在492nm波长处读取各孔的光密度值；

G)OD值到浓度的换算：将标准曲线直线化：设样本孕酮浓度为X，结合率(E/E0：样品孔的OD值/零标准孔的OD值))为y可得方程y＝a+blnx，利用回归方程即可求得待测样本的孕酮含量pg/100ul工作液。

所述步骤(1)中的测定缓冲液为碳酸盐缓冲液(pH值为9.6)、Tris盐酸缓冲液(pH值为7.4)、磷酸盐缓冲液(pH值为7.4)或蒸馏水(pH值为7.0)，优选蒸馏水。

所述标准曲线的回归方程为：E/E0＝-8.387lnx+108.7(r＝-0.9932)。

一种检测母猪发情期的方法：利用上述方法测定母猪粪便中的孕酮浓度，然后做出判断：空怀母猪粪样孕酮含量为50～200ng/g时，可以确认为发情；当配种后母猪孕酮的含量超过330ng/g粪样时，可以确认其妊娠；小于190ng/g粪样时，可以确认其没有妊娠。