[发明专利]超声波辅助黄粉虫幼虫蛋白酶解制备的降血压肽及制备方法

权利要求书

1.超声波辅助黄粉虫幼虫蛋白酶解制备的降血压肽，其氨基酸序列为丝氨酸－蛋氨酸（Ser-Met），分子量为236 Da。

2.超声波辅助黄粉虫幼虫蛋白酶解制备的降血压肽，其氨基酸序列为酪氨酸-丙氨酸-天冬酰胺（Tyr-Ala-Asn），分子量为366 Da。

3.超声波辅助黄粉虫幼虫蛋白酶解制备降血压肽的方法，其特征在于按照下述步骤进行：

（1）原料的处理

将干燥的黄粉虫幼虫粉进行超临界CO₂脱脂，定量称取脱脂黄粉虫幼虫粉，加蒸馏水配制成质量与体积比为2%～6%溶液，使用功率250～1250 W的脉冲超声波进行底物预处理，超声波处理时间5～30 min，对应一个脉冲的超声波发出时间2～4 s、间隙时间2 s；

（2）可控酶解反应

将超声波处理后的脱脂黄粉虫幼虫溶液pH调至7.5～9.5，在恒温水浴中加热至40 ℃～60 ℃，按照酶与底物质量比例0.02～0.04:1加入蛋白酶，水解度达到20%时停止反应，期间不断搅拌；酶解结束后，将酶解液置于沸水浴中加热20 min灭酶，冷却至常温，将酶解液pH值调至7.0，离心后取上清液浓缩，冻干；

（3）降血压肽的分离纯化

利用葡聚糖凝胶G-15对黄粉虫幼虫降血压肽进行初步纯化，色谱柱规格1.6 × 60 cm；洗脱液为超纯水；洗脱速度1 mL/min；上样量2～5 mL；样品浓度约20 mg/mL；检测波长220 nm；

将经葡聚糖凝胶G-15分离得到的对ACE抑制活性最高的组分进行反相高效液相色谱分离纯化，分离条件：流动相为乙腈：水（含0.05%醋酸）=5:95(v/v)；洗脱模式为等度洗脱；上样量450 μL；样品浓度26.5 mg/mL；色谱柱Sunfire Pre C18 column (10 × 250 mm，5μm )；柱温35 ℃；流速2.2 mL/min；将经过第一次液相色谱制备的活性较高的组分利用反相高效液相色谱进行进一步纯化，流动相为乙腈（含0.05%醋酸）：水（含0.05%醋酸）=5:95(v/v)；洗脱模式为等度洗脱；样品浓度为200 μg/mL；柱温35 ℃；上样量为100 μL；流速为2.0 mL/min；即可得到上述黄粉虫幼虫降血压活性肽。

4.权利要求3所述的超声波辅助黄粉虫幼虫蛋白酶解制备降血压的方法，其特征在于其中步骤1和2按照下述步骤进行：

（1）蛋白酶的处理

将蛋白酶用适当的缓冲溶液稀释后，使用功率50～300 W的脉冲超声波进行处理，超声波处理时间5～30 s，对应一个脉冲的超声波发出时间2 s、间隙时间2 s；

（2）可控酶解反应

将干燥的黄粉虫幼虫粉进行超临界CO₂脱脂，定量称取脱脂黄粉虫幼虫粉，加蒸馏水配制成质量与体积比2%～6%溶液，水浴加热至40 ℃～60 ℃，将溶液pH调至7.5～9.5，按照酶与底物质量比例0.02～0.04:1加入超声波处理后的蛋白酶进行酶解，水解度达到20%时停止反应，期间不断搅拌；

酶解结束后，将酶解液置于沸水浴中加热20 min灭酶，冷却至常温，将酶解液pH调至7.0，离心后取上清液浓缩，冻干。

5.根据权利要求3所述的超声波辅助黄粉虫幼虫蛋白酶解制备降血压的方法，其特征在于其中步骤1和2按照下述步骤进行：

（1）原料及蛋白酶的处理

将干燥的黄粉虫幼虫粉进行超临界CO₂脱脂，定量称取脱脂黄粉虫幼虫粉，加蒸馏水配制成质量与体积比为2%～6%溶液，使用功率250～1250 W的脉冲超声波进行底物预处理，超声波处理时间5～30 min，对应一个脉冲的超声波发出时间2～4 s、间隙时间2 s；

将蛋白酶用适当的缓冲溶液稀释后，使用功率50～300 W的脉冲超声波进行处理，超声波处理时间5～30 s，对应一个脉冲的超声波发出时间2 s、间隙时间2 s；

（2）可控酶解反应

将超声波处理后的脱脂黄粉虫幼虫溶液水浴加热至50 ℃，将溶液pH调至7.5～9.5，按照酶与底物质量比例0.02～0.04:1加入超声波处理后的蛋白酶进行酶解，水解度达到20%时停止反应，期间不断搅拌；

酶解结束后，将酶解液置于沸水浴中加热20 min灭酶，冷却至常温，将酶解液pH调至7.0，离心后取上清液浓缩，冻干。

6.根据权利要求3、4或5所述的超声波辅助黄粉虫幼虫蛋白酶解制备降血压的方法，其特征在于其中使用的蛋白酶为碱性蛋白酶。