[发明专利]超声波辅助黄粉虫幼虫蛋白酶解制备的降血压肽及制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及利用黄粉虫幼虫蛋白制备出两种未见报道的降血压肽及其制备、纯化方法，属于生物工程技术领域。 

背景技术

高血压是当今发病率最高的心血管疾病，其中95%以上的患者是原发性高血压。血管紧张素转换酶（ACE）在人体血压调节过程中起着重要的作用，通过抑制ACE活性可有效地降低原发性高血压。虽然合成的ACE抑制剂（ACEI）具有明显的降血压作用，但同时也具有许多不良反应。因而，寻求安全的ACEI成为世界各国学者研究的热点，现已发现一些生物活性肽能够抑制ACE活性，从而具有降血压作用。ACE抑制肽的研究在国外始于上世纪六、七十年代，而国内从九十年代后期开始才逐渐有报道。活性肽来源一般分为从自然界生物体中提取、化学合成和蛋白质酶解等三种方法。其中，从生物体中提取活性肽存在提取步骤繁琐及得率低等问题，目前研究相对较少。化学合成多肽也有费时费力，成本昂贵等不足。而采用蛋白酶水解各种来源蛋白质制备活性肽是一种较合理的途径。目前，人们已成功地以酪蛋白、水产品、玉米、大豆、鸡蛋、乳制品等为原料，经过蛋白酶酶解制备出降血压肽，但上述降血压肽的制备原料均为人类的生活食物。 

国内外许多学者发现，分子量较小的多肽对ACE的抑制活性较强。其中二肽、三肽与游离氨基酸的吸收转移系统不同，这类小分子多肽较游离氨基酸更易被人体直接吸收，且只有进入到血液循环中的降血压肽才能发挥其降压作用。 

传统的蛋白质酶解制备降血压肽的方法所需时间一般较长，利用一些物理手段对底物或参与反应的其它物质进行预处理往往能够加快水解进程。近年来，超声波技术在食品加工领域的应用越来越广泛，尤其在有效成分的提取方面应用较多，而利用超声波技术加快蛋白质酶解的报道较少。迄今为止，尚未有超声波辅助黄粉虫幼虫蛋白酶解制备降血压肽的报道。 

黄粉虫（Tenebrio molitor L）是一种在世界范围内分布的仓储害虫。黄粉虫幼虫是一种高蛋白、高脂肪、矿物质元素及维生素含量丰富、氨基酸组成合理的昆虫资源。其体内蛋白质含量高达50%（干重），素有“动物蛋白饲料之王”的称誉。黄粉虫易于饲养，山东、山西、河南、江苏、陕西、湖南、广西、福建、安徽等地均有养殖，因此，我国的黄粉虫资源非常丰富。长期以来，由于对其缺乏系统的研究，黄粉虫幼虫主要用于活食喂养鸟禽类动物或饲料生产，使大量的优质蛋白资源被浪费，因此开发利用黄粉虫幼虫蛋白资源具有重要的意义与广阔的前景。 

目前，国内外对于利用黄粉虫幼虫这一来源广泛、价格低廉的蛋白质资源制备降血压肽的技术尚未见报道。 

发明内容

本发明的目的之一是克服传统的蛋白质酶解所用时间长的特点，利用超声波预处理脱脂黄粉虫幼虫蛋白或者在酶解前对所用蛋白酶进行适当的超声波处理从而达到提高水解速率、缩短酶解时间及改善酶解效果的目的。 

本发明的目的之二是克服大分子多肽及蛋白质吸收性差以及活性和纯度不高等方面的不足，获得两种成本低、纯度高、效果好的黄粉虫幼虫蛋白源降血压肽。 

超声波辅助黄粉虫幼虫蛋白酶解制备的降血压肽，其氨基酸序列为丝氨酸－蛋氨酸（Ser-Met），分子量为236 Da。 

超声波辅助黄粉虫幼虫蛋白酶解制备的降血压肽，其氨基酸序列为酪氨酸-丙氨酸-天冬酰胺（Tyr-Ala-Asn），分子量为366 Da。 

一、超声波辅助黄粉虫幼虫蛋白酶解制备降血压肽的方法按照下述步骤进行： 

1. 原料的脱脂及超声波预处理

将干燥的黄粉虫幼虫粉进行超临界CO₂脱脂，脱脂条件：萃取压力35 MPa，萃取温度35 ℃，萃取时间200 min，常压分离。称取一定量脱脂黄粉虫幼虫粉，加蒸馏水配制成2%～6%（w/v）的溶液，使用功率250～1250 W的脉冲超声波进行底物预处理，超声波处理时间5～30 min，对应一个脉冲的超声波发出时间2～4 s、间隙时间2 s。

2.可控酶解反应 

将超声波处理后的脱脂黄粉虫幼虫蛋白溶液pH调至7.5～9.5，在恒温水浴中加热至40～60 ℃，按照酶与底物比例0.02～0.04:1（g/g）加入使用蛋白酶，水解度达到20%时停止反应，期间不断搅拌并用0.2 mol/L NaOH维持酶解液pH恒定。酶解结束后，将酶解液置于沸水浴中加热20 min灭酶，冷却至常温，将酶解液pH值调至7.0，浓缩冻干。

3. 降血压肽的分离纯化