[发明专利]制备二肽基肽酶IV抑制剂的方法及用于该制备方法的中间体

权利要求书

1.一种制备式3结构的经BOC-保护的胺的方法,

式3

其包括

a.制备部分纯化的苯丙氨酸脱氢酶/甲酸脱氢酶的酶浓缩物；及

b.使用甲酸铵、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、二硫苏糖醇及该部分纯化的苯丙氨酸脱氢酶/甲酸脱氢酶的酶浓缩物处理式1结构的酮酸的水溶液；

式1

c.使用氢氧化钠调节反应混合物的pH以形成基本上不含有不希望的过量铵离子的所需的胺；及

式2

d.在不离析该氨基酸中间体的情况下，使用二碳酸二叔丁酯处理上述水溶液以生成以下结构的经BOC-保护的胺

式3

2.权利要求1所述的方法，其中进行调节该反应混合物的pH的步骤以将该反应混合物的pH维持在约7.0至约8.6。

3.权利要求1的方法，其中进行调节该反应混合物的pH的步骤以将该反应混合物的pH维持在8.0±0.2。

4.权利要求1-3中任一项的方法，其中以这样的量添加甲酸铵，以提供约1.9:1至约2.5:1的范围内的甲酸铵:式1酸的摩尔比例。

5.权利要求1-4中任一项的方法，其中以这样的量添加烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，以提供约500:1至约1500:1的范围内的NAD:式1酸的摩尔比例。

6.权利要求1-5中任一项的方法，其中步骤c的反应混合物维持在约25℃至45℃的范围内的温度。

7.权利要求1-6中任一项的方法，其中该部分纯化的苯丙氨酸脱氢酶/甲酸脱氢酶浓缩物经由包括下列步骤的方法制备：

a.制备能够产生苯丙氨酸脱氢酶和/或甲酸脱氢酶的微生物的发酵培养液；

b.对该培养液进行微流体化以从所得的细胞中释放出活性且形成具有PDH及/或FDH活性的微流体化的培养液；

c.经由使用絮凝剂处理该培养液以凝结细胞碎屑而澄清该培养液；

d.过滤该澄清的培养液；及

e.浓缩该培养液以得到具有对于PDH为至少约400IU/毫升和对于FDH为至少约20IU/毫升的PDH/FDH活性的经纯化的酶浓缩物。

8.权利要求7的方法，其中在保持该培养液的温度低于约40℃的同时对该培养液进行微流体化。

9.权利要求8的方法，其中保持该培养液的温度在约4℃至约30℃的范围内。

10.权利要求1-6中任一项的方法，其中部分纯化的苯丙氨酸脱氢酶/甲酸脱氢酶(PDH/FDH)是通过包括下述的方法制备的：

a.制备能够产生苯丙氨酸脱氢酶及甲酸脱氢酶的大肠杆菌(Escherichia coli)的发酵培养液；

b.在8000至30,000psi范围内的压力下对该培养液进行微流体化，同时保持该培养液的温度在4至30℃的范围内，以从所得的细胞中释放出活性且形成含有苯丙氨酸脱氢酶及甲酸脱氢酶的微流体化培养液；

c.经由使用絮凝剂处理该培养液以凝结细胞碎屑并除去DNA和不需要的蛋白质而澄清该培养液；

d.过滤该澄清的培养液；及

e.浓缩该培养液以得到具有对于苯丙氨酸脱氢酶为至少约400IU/毫升和对于甲酸脱氢酶为至少约20IU/毫升的苯丙氨酸脱氢酶及甲酸脱氢酶活性的部分纯化的酶浓缩物。

11.权利要求7-10中任一项的方法，其中在约12,000至约20,000psi范围内的压力下对该培养液进行微流体化。

12.权利要求7-11中任一项的方法，其中该苯丙氨酸脱氢酶得自芽孢八迭球菌属(Sporosarcina)或热放线菌属(Thermoactinomyces)。

13.权利要求7-11中任一项的方法，其中该苯丙氨酸脱氢酶得自中间型嗜热放线菌(Thermoactinomyces intermedius)。

14.权利要求7-11中任一项的方法，其中该苯丙氨酸脱氢酶得自中间型嗜热放线菌ATCC33205，其在大肠杆菌或巴斯德毕氏酵母(Pichia pastoris)中表达。