[发明专利]含有副猪嗜血杆菌OppA重组蛋白抗原的副猪嗜血杆菌病正向间接血凝诊断试剂及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体涉及副猪嗜血杆菌OppA重组蛋白抗原及其编码基因，以及含有副猪嗜血杆菌OppA重组蛋白抗原的副猪嗜血杆菌病正向间接血凝诊断试剂。 

背景技术

副猪嗜血杆菌病是由副猪嗜血杆菌( Haemophilus Parasuis , Hps) 引起猪的以纤维素性浆膜炎、多发性关节炎和脑膜炎为特征的传染病。该病在全世界均有发生，通常见于5-8周龄的猪，发病率一般在10%-15%，严重时死亡率可达50%。近年来此病在规模化猪场的感染率和所致的死亡率日益增高，已为危害养猪业较严重的细菌性疾病之一。 

副猪嗜血杆菌病是世界性分布的条件性疾病，许多猪场有该病的存在。近年来我国养猪业发展很快，而饲养管理技术水平却相对滞后，饲养环境条件恶劣，疫病日益复杂，猪群健康水平下降，大多处于亚健康状态，这就为本病的发生与流行创造了条件。及时、准确地诊断出该病以便采取相应的措施是成功防制副猪嗜血杆菌病的关键。副猪嗜血杆菌的血清型众多，有15个血清型，还有20%分离株无法分型，所以给副猪嗜血杆菌病的诊断带了很大的困难，尤其是血清学诊断。 

随着分子生物学技术的发展，分子技术在细菌诊断领域广泛的应用，分子诊断在副猪嗜血杆菌的诊断中得到了广泛的应用，如基因限制性片段长度多态性分型（RFLP）技术(de la 2003；del Rio 2006等)、限制性内切酶技术（ERP）(Smart  1988)、肠杆菌基因间保守重复序列（ERIC）(Rafiee 2000)、单基因座序列分型技术和多为点序列分型（MLST）（Olvera 2006），由于这些诊断方法需要专业的设备和技术，所以在临床上很难推广应用。 

Miniats（1991）等用副猪嗜血杆菌的煮沸物或超声波破碎物致敏新鲜绵羊红细胞建立了IHA和用副猪嗜血杆菌的煮沸物或热酚水透析物建立了ELISA诊断方法；石碧（2007）等用副猪嗜血杆菌血清5型荚膜多糖建立了IHA和ELISA诊断方法，检测效果明显优于前者。IHA和ELISA是目前国内外学者探索的主要副猪嗜血杆菌病抗体检测方法，所不同的是抗原的制备方法不同。但是这些诊断方法均具有一定的局限性，全菌超破抗原成分复杂，缺乏特异性，荚膜多糖抗原抗原虽有很好的特异性，但只能检测相应血清型的单一抗体。但在国内，副猪嗜血杆菌流行的血清型比较复杂，主要有血清型4型、5型，12型，13型，其他血清型在临床上偶能发生，所以单一抗体检测试剂不能满足实际生产需要。 

发明内容

本发明的目的就是针对上述现有技术中的缺陷，提供了一种检测快速方便，实用性强的含有副猪嗜血杆菌OppA重组蛋白抗原的副猪嗜血杆菌病正向间接血凝诊断试剂及其制备方法。 

为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为：副猪嗜血杆菌OppA重组蛋白抗原，具有序列表中SEQ ID No：2的氨基酸序列。 

本发明的第二个目的是提供了编码上述副猪嗜血杆菌OppA重组蛋白抗原的基因。 

进一步的，上述的副猪嗜血杆菌OppA重组蛋白抗原的基因，所述基因具有序列表中SEQ ID No：1的核苷酸序列。 

本发明的第三个目的是提供了含有基因的表达载体、转基因细胞系和宿主菌。 

本发明的第四个目的是提供了表达副猪嗜血杆菌OppA重组蛋白抗原的方法，是将含有上述的副猪嗜血杆菌OppA重组蛋白抗原基因导入宿主细胞，表达得到副猪嗜血杆菌OppA重组蛋白抗原。 

进一步的，上述的方法，构建所述重组表达载体的出发载体为pET-30a；所述宿主为大肠杆菌BL21。 

本发明的第五个目的是提供了含有上述副猪嗜血杆菌OppA重组蛋白抗原的副猪嗜血杆菌病正向间接血凝诊断试剂。 

本发明的第六个目的是提供了上述副猪嗜血杆菌病正向间接血凝诊断试剂的制备方法，是将表达得到副猪嗜血杆菌OppA重组蛋白纯化后进行复性，将纯化复性的OppA重组蛋白稀释为6-20mg/ml，之后与等量的5%醛化-鞣酸化绵羊红细胞悬液混合，在37℃水浴中感作30分钟，期间每10分钟振摇一次，离心弃去上清，沉淀用pH7.2，浓度0.1mol/L的PBS悬浮，以3000rpm离心2分钟，洗涤2次；再用含1%灭活健兔血清的PBS悬浮，PBS的pH为7.2，浓度为0.1mol/L，以3000rpm离心2分钟，洗涤1次；最后将沉淀用含1%灭活健兔血清的PBS稀释成1%的致敏红细胞悬液，PBS的pH为7.2，浓度为0.1mol/L，分析检测合格即为副猪嗜血杆菌病正向间接血凝诊断试剂。