[发明专利]利用HVA1基因的半定量PCR法鉴定青稞抗旱性的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及的是一种利用HVA1基因的半定量PCR法鉴定青稞抗旱性的方法。

背景技术

高等植物胚胎发育晚期丰富蛋白(late embryogenesi s abundant proteins，LEA proteins)是种子发育后期产生的一类小分子特异多肽，这类蛋白与植物耐脱水性密切相关，受植物的发育阶段、ABA和脱水信号的调节(Sun et al.，2003；Ramanjulu，2002)。自1981年首次在胚胎发育后期的棉花子叶中分离到了一组丰富表达的mRNA，命名为leamRNA，同时还分离到其表达产物，即LEA蛋白(Dure et al.，1981)，目前已从各种植物中发现了许多新的LEA蛋白。根据蛋白中氨基酸序列的同源性及一些特殊基元序列，可将LEA蛋白分为6组(Bray，1993；Wise et al.，2004；张改娜等，2005)。在LEA蛋白基因中LEA2蛋白基因和LEA3蛋白基因是麦谷类作物中研究最多的2类与抗旱和抗盐有关的基因(Ried and Walker-Simmons，1993；Suprunova et al.，2004)。来自普通大麦(Hordeum vulgare L.)的HVA1基因编码大麦类群第3组LEA蛋白(LEA3蛋白)，通常含有多拷贝的11个氨基酸构成的保守基元序列(TAQAAKEKAGE)，该基元序列可形成兼性α-螺旋结构，在植物细胞脱水时提供疏水区的亲水表面(Dure，1993；俞嘉宁，2002；Choi，1999)。大量研究表明，LEA蛋白在植物耐受干旱和盐胁迫过程中发挥着重要的功能。Xu(1996)和Sivamani(2000)等通过转基因分析表明，来源于大麦的L EA类基因HVA1过表达后可以显著提高转基因水稻和小麦的抗旱及耐盐能力，这项研究为支持LEA蛋白在植物抗水分和盐胁迫时起保护作用的假说提供了直接的证据。余嘉宁(2005)等从小麦中克隆了L EA3基因，转入酵母系统表达后与对照相比，其抵抗干旱和低温胁迫能力显著增强。该基因的抗旱、耐盐功能在烟草(李楠，2007)和桑树(Lal S et al，2008)中也得到了实验证实。但也有相反报道，如：从耐脱水复活植物Craterostigma Plantagineum分离出一个第3组LEA基因，PcC3-06，将其转到烟草中高效表达，但转基因烟草在抗旱性方面并没有得到提高(Bimei et al.，1992)。因此对于第3组LEA蛋白基因的在青稞细胞中的表达及其与与抗旱性的关系还有待进一步的深入研究。

目前抗旱性鉴定多采用生理生化的方法，这种方法比较繁琐，仅靠一两个生理指标很难鉴定植物的抗旱性，因而耗时比较长，而且没有固定的生理生化指标可以确定植物的抗旱性。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足提供一种利用HVA1基因的半定量PCR法鉴定青稞抗旱性的方法。

本发明的技术方案如下：

利用HVA1基因的半定量PCR法鉴定青稞抗旱性的方法，包括以下步骤：

(1)青稞两叶期时开始用0-30％的PEG胁迫处理4天；

(2)采用上海生工总RNA提取试剂盒和逆转录试剂盒对叶片进行总RNA的提取及逆转录；

(3)以大麦肌动蛋白(β-Actin)基因为内参基因对目标基因HVA1的扩增，引物如下：

(4)采用Gel-pro软件对所得HVA1基因相对表达量图进行二次函数的拟合；

(5)根据拟合曲线计算HVA1基因的相对最高表达量或者对应的PEG浓度，其数值大者为抗旱性强的青稞品种。

由于植物的抗旱性是一个数量性状，没有明确的找到一个控制抗旱性的主效基因，而本发明利用了大麦LEA3蛋白的一个基因HVA1，检测了其在不同干旱胁迫下不同抗旱性青稞的表达量，从中找到了该基因的表达模型，确定了不同抗旱性的青稞品种与该基因表达量的关系。

附图说明

图1为HVA1基因表达的半定量PCR分析；

图2为HVA1基因在模拟干旱胁迫下的表达模式(目标基因/β-Actin)；

图3为HVA1基因在模拟干旱胁迫下的表达量(目标基因/PKABA)(不同小写和大写字母分别表示处理间在0.05和0.01水平有显著差异)。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。

表1引物名称及序列