[发明专利]一种体外人卵母细胞腔前卵泡培养方法

说明书

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，为一种体外人卵母细胞腔前卵泡培养方法。

背景技术

近年来，随着有关胚胎工程技术尤其是试管婴儿技术的的不断发展，对卵母细胞的需求日益增加，单纯利用体内成熟的卵母细胞已不能满足医学需求，人们开始着眼于研究具有巨大卵母细胞来源潜力的腔前卵泡的开发和利用。但常规的腔前卵泡培养时颗粒细胞增生分化不足从而导致卵泡发育存在缺陷，卵泡在营养液中的存活天数很短，培养难度大、成功率低且不稳定，使得腔前卵泡培养达不到预期的效果而影响其进一步的研究。

发明内容

本发明的目的是这样实现的：一种体外人卵母细胞腔前卵泡培养方法，其具体步骤包括：1)将放在含蔗糖和丙二醇的冷冻保护液中的并进行液氮低温贮存的体外人卵母细胞解冻后复苏培养；2)将复苏培养获取的体外人卵母细胞分离提取后放入含有卵泡雌激素FSH的营养液中进行腔前培养。在在进行培养过程中加入一定量的曲古柳菌素A(TSA)。步骤2)的具体方法是：配置营养液，在基本营养液Ham‘sF-10中加入青霉素110IU/ml，链霉素60μg/ml，并添加17％的脐带血清FCS，并加入浓度为2.3IU/ml的卵泡雌激素FSH；将获取的体外人卵母细胞在含17％的FCS的Ham‘sF-10清洗后移入营养液微滴中，微滴上覆矿物油，在37℃、5％CO2、饱和湿度的二氧化碳培养箱中进行培养，并每24小时换液一次。加入的曲古柳菌素A(TSA)在营养液中的浓度为200μg/1。

通过低温贮存能够提高体外人卵母细胞冻存后的存活率及减数分裂等各项功能的恢复，提高复速率。而卵泡刺激素(FSH)是垂体分泌的一种糖蛋白激素，其主要作用是促进颗粒细胞增生分化，调节卵泡的发育。体外人卵母细胞腔前卵泡培养需要FSH的支持，FSH不仅能促进卵泡的生长，增加其存活天数，能促进颗粒细胞增殖，促进卵母细胞成熟，是卵泡生长发育调控的重要因子。曲古柳菌素A可有效抑制肿瘤细胞增殖，可为调控细胞周期进程进而诱导肿瘤细胞凋亡，从而保证细胞成活质量，该方法对于试管婴儿方面的研究具有重要意义。

附图说明

图1是贮体外人卵母细胞贮存方法流程示意图；

图中，1为：冷冻浸泡预处理；2为程序降温冷冻和低温贮存；3为快速升温解冻；4为复苏后培养；

图2是体外人卵母细胞腔前培养图；

图3是加入曲古柳菌素A(TSA)的细胞分组柱状图。

具体实施方式

实施例1

一种体外人卵母细胞腔前卵泡培养方法，其特征在于培养方法的具体步骤包括：

1)将放在含蔗糖和丙二醇的冷冻保护液中的并进行液氮低温贮存的体外人卵母细胞解冻后复苏培养；

2)将复苏培养获取的体外人卵母细胞分离提取后放入含有卵泡雌激素FSH的营养液中进行腔前培养。

优选地，进行培养过程中加入一定量的曲古柳菌素A(TSA)。

优选地，步骤2)的具体方法是：配置营养液，在基本营养液Ham‘sF-10中加入青霉素110IU/ml，链霉素60μg/ml，并添加17％的脐带血清FCS，并加入浓度为2.3IU/ml的卵泡雌激素FSH；将获取的体外人卵母细胞在含17％的FCS的Ham‘sF-10清洗后移入营养液微滴中，微滴上覆矿物油，在37℃、5％CO2、饱和湿度的二氧化碳培养箱中进行培养，并每24小时换液一次。

优选地，加入的曲古柳菌素A(TSA)在营养液中的浓度为200μg/1。

参见图1，本发明是一种体外人卵母细胞腔前卵泡培养方法，首先是将体外人卵母细胞贮存在含蔗糖和丙二醇的冷冻液里进行浸泡冷冻预处理1，再进行程序化的缓慢降温冷冻，然后低温贮存于液氮中，即降温冷冻和低温贮存2；在需要使用时，先使该体外人卵母细胞快速升温解冻3，使之复苏，再将已解冻复苏的该体外人卵母细胞放入序贯培养液中，置于37±0.2℃、5％～6％CO2浓度的孵箱进行培养4，以供体外受精。