[发明专利]一种苯胺绿人工抗原的制备方法

权利要求书

1.一种苯胺绿人工抗原的制备方法，其特征在于按以下步骤进行：

(1) 、制备人工半抗原---半抗原4-MGC 的合成:

 　　(a)、 将质量摩尔比为2:1的N,N- 二甲基苯胺和4- 羧基苯甲醛加入到圆底烧瓶中，N,N- 二甲基苯胺为3g，在温度为100℃下搅拌反应6小时，形成反应液；反应结束后反应液用乙醚提取，转干，经重结晶后得到白色固体产物Ⅰ；

     (b)、 在产物Ⅰ中加入苯30ml以及催化量Amberlyst 15 resin一起放入圆底烧瓶中，在氮气的保护下,在温度为130℃下进行回流搅拌过夜，形成溶剂；反应结束后，将溶剂减压后转干，用乙醚提取得到产物Ⅱ; 

     (c)、 将产物Ⅱ经硅胶柱层析纯化后,提取得到半抗原4-MGC的白色固体；

(2) 、制备苯胺绿人工抗原---苯胺绿-BSA的合成:

 　　(d)、 称取0.425g 的半抗原4-MGC和0.225g 的N- 羟基琥珀酰亚胺溶于

10.0ml的N,N- 二甲基甲酰胺中,存放于烧杯中,再将溶解了0.255g N，N- 二环己基碳二亚胺的10.0mlN,N- 二甲基甲酰胺的溶液慢慢滴加,边滴加边磁力搅拌,搅拌结束后在温度为20℃下进行磁力搅拌过夜,得到A液；

    (e) 、将牛血清蛋白溶于PBS缓冲液中，得到浓度为5mg/ml的B液；

(f) 、在常温磁力搅拌条件下,将A液逐滴加入到装有10ml的B液中,得到人工抗原混合液，在温度为4℃的冰箱内进行磁力搅拌过夜;

    (g)、 制备钠离子浓度为0.1mol/L的PBS缓冲液，pH为7.2～7.4；

    (h)、 将人工抗原混合液于PBS缓冲液中进行透析，在温度为4℃下进行搅拌透析,每4小时换一次PBS缓冲液,透析时间为2天，形成透析液, 紫外扫描透析液无小分子吸收峰时,将产物离心取上清,在无菌条件下通过0.2μm 的滤膜，即得到人工抗原：苯胺绿-牛血清蛋白。