[发明专利]一种苯胺绿人工抗原的制备方法

说明书

 

技术领域

   本发明涉及一种苯胺绿人工抗原，尤其涉及一种苯胺绿人工抗原的制备方法。

背景技术

苯胺绿在中文名又称孔雀石绿;中国绿;碱性孔雀石绿;品绿;盐基块绿;英文名称：MalachiteGreen oxalate,苯胺绿是绿色有金属光泽的晶体，易溶于水，溶于乙醇、甲醇和戊醇，水溶液呈蓝绿色，pH0.0以下呈黄色；最大吸收波长616.9nm. 是有毒的三苯甲烷类化学物，既是染料，也是杀菌剂，可致癌。其结构式为：

 苯胺绿中的化学功能团三苯甲烷可致癌，很多国家已经禁用，但仍有渔民在防治鱼类感染真菌时使用。也有运输商用作消毒，以延长鱼类在长途贩运中的存活时间。虽然于2002年5月中国农业部已将孔雀石绿列入《食品动物禁用的兽药及其化合物清单》，但于2005年8月，福建、江西及安徽等地出口的鳗鱼产品，被验出含有孔雀石绿，国家质检总局首次下令全面回收，数日后香港更发现多种淡水鱼含有孔雀石绿，中国因此禁止所有淡水鱼出口到香港。同年9月1日香港更于来自台湾的青斑海鱼样本中验出孔雀石绿。台湾渔业署对事件表示“讶异”，并表示会作出针对性检验。

  目前，对苯胺绿的检测主要依靠高效液相色谱法（HPLC）,气相色谱（GC），薄层色谱（TLC），质朴（MS)等，但是存在仪器昂贵，检测费时，并且需要专业技术人员进行操作，不能达到现代检测对快速，准确的要求。而免疫分析法可以弥补以上所有缺点，免疫分析法是一种利用抗原抗体特异性结合反应检测各种物质（药物、激素、蛋白质、微生物等）的分析方法, 该方法的前提就是需要提供特异性的抗原和抗体。

发明内容

   本发明主要是解决现有技术中存在的不足，提供一种苯胺绿人工抗原的制备方法，所制备的苯胺绿人工抗原可进行动物免疫，取得相应的苯胺绿抗体，可用于各种苯胺绿类免疫分析法的研究，为苯胺绿的检测提供更加方便快速准确的途径。

   本发明的上述技术问题主要是通过下述技术方案得以解决的： 

  一种苯胺绿人工抗原的制备方法，按以下步骤进行：

(1) 、制备人工半抗原---半抗原4-MGC 的合成:

 (a)、 将质量摩尔比为2:1的N,N- 二甲基苯胺和4- 羧基苯甲醛加入到圆底烧瓶中，N,N- 二甲基苯胺为3g，在温度为100℃下搅拌反应6小时，形成反应液；反应结束后反应液用乙醚提取，转干，经重结晶后得到白色固体产物Ⅰ；

     (b)、 在产物Ⅰ中加入苯30ml以及催化量Amberlyst 15 resin一起放入圆底烧瓶中，在氮气的保护下,在温度为130℃下进行回流搅拌过夜，形成溶剂；反应结束后，将溶剂减压后转干，用乙醚提取得到产物Ⅱ; 

     (c)、 将产物Ⅱ经硅胶柱层析纯化后,提取得到半抗原4-MGC的白色固体；

  半抗原4-MGC为半抗原4-(双(4- 二甲胺基)苯基)甲基)苯甲酸(4-MGC)。

(2) 、制备苯胺绿人工抗原---苯胺绿-BSA的合成:

 (d)、 称取0.425g 的半抗原4-MGC和0.225g 的N- 羟基琥珀酰亚胺溶于

10.0ml的N,N- 二甲基甲酰胺中,存放于烧杯中,再将溶解了0.255g N，N- 二环己基碳二亚胺的10.0mlN,N- 二甲基甲酰胺的溶液慢慢滴加,边滴加边磁力搅拌,搅拌结束后在温度为20℃下进行磁力搅拌过夜,得到A液；

    (e) 、将牛血清蛋白溶于PBS缓冲液中，得到浓度为5mg/ml的B液；

(f) 、在常温磁力搅拌条件下,将A液逐滴加入到装有10ml的B液中,得到人工抗原混合液，在温度为4℃的冰箱内进行磁力搅拌过夜;

    (g)、 制备钠离子浓度为0.1mol/L的PBS缓冲液，pH为7.2～7.4；

    (h)、 将人工抗原混合液于PBS缓冲液中进行透析，在温度为4℃下进行搅拌透析,每4小时换一次PBS缓冲液,透析时间为2天，形成透析液, 紫外扫描透析液无小分子吸收峰时,将产物离心取上清,在无菌条件下通过0.2μm 的滤膜，即得到人工抗原：苯胺绿-牛血清蛋白。