[发明专利]一种黄瓜绿斑驳花叶病毒的RT-LAMP快速检测试剂盒及检测方法

权利要求书

1.一种用于黄瓜绿斑驳花叶病毒快速检测的RT-LAMP引物组，其特征在于所述的RT-LAMP引物组包含一对外引物和一对内引物，所述外引物对F3、B3的序列分别为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示，所述内引物对FIP、BIP的序列分别为SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示。

2.权利要求1所述的引物组在制备黄瓜绿斑驳花叶病毒的快速检测试剂盒或检测试剂中的应用。

3.一种含有权利要求1所述的引物组的黄瓜绿斑驳花叶病毒RT-LAMP快速检测试剂盒。

4.根据权利要求3所述的黄瓜绿斑驳花叶病毒RT-LAMP快速检测试剂盒，其特征在于所述的试剂盒包含主要由植物病毒RNA快速提取液、RT-LAMP反应液、DEPC水和荧光染料SYBR GreenⅠ检测液组成的检测体系。

5.根据权利要求4所述的黄瓜绿斑驳花叶病毒RT-LAMP快速检测试剂盒，其特征在于所述植物病毒RNA快速提取液包含0.5M NaOH和Tris-HCL（pH8.0）；采用植物病毒RNA快速提取液提取样品粗提总RNA，将提取的样品粗提总RNA加入到RT-LAMP反应液中混合，建立扩增体系；以反应总体积10μL为例，所述扩增体系中各组分的含量为：样品粗提总RNA 0.8μL，1×ThermoPol Buffer，4mM MgCl₂，0.8mM dNTP，0.8M Betaine，3.2U 的Bst DNA Polymerase，0.5U 的AMV Polymerase，1μM 的FIP和1μM 的BIP，0.2μM的F₃和0.2μM的B₃，补充DEPC水至10μL。

6.一种黄瓜绿斑驳花叶病毒的RT-LAMP快速检测方法，其特征在于使用权利要求1所述的引物组对待测样品进行RT-LAMP扩增，利用电泳检测或荧光染料技术鉴定出待检测样本中是否含有黄瓜绿斑驳花叶病毒。

7.根据权利要求6所述的黄瓜绿斑驳花叶病毒的RT-LAMP快速检测方法，其特征在于具体包括以下步骤：

（1）提取样品粗提总RNA；

（2）取步骤（1）提取的样品粗提总RNA加入到RT-LAMP反应液中混合，建立扩增体系；

（3）在63~64℃恒温水浴中反应60~75min；

（4）结果诊断：取荧光染料检测液SYBR GreenⅠ加入到步骤（3）扩增反应产物中进行诊断，在紫外光下观察，呈阳性即显绿色的表示样本中含有黄瓜绿斑驳花叶病毒，呈阴性即保持染料橙色的表示样本不含有黄瓜绿斑驳花叶病毒。

8.根据权利要求7所述的黄瓜绿斑驳花叶病毒的RT-LAMP快速检测方法，其特征在于步骤（1）所述样本粗提总RNA的提取方法为：用刚采集的病叶在0.5M NaOH溶液中快速研磨制成研磨液，将研磨液加入到Tris-HCL（pH8.0）中制成样品粗提总RNA提取液。

9.根据权利要求8所述的黄瓜绿斑驳花叶病毒的RT-LAMP快速检测方法，其特征在于所述的病叶和0.5M NaOH溶液的质量体积比g：mL为1：4；所述混合液和Tris-HCL（pH8.0）的体积比为1：49。

10.根据权利要求7所述的黄瓜绿斑驳花叶病毒的RT-LAMP快速检测方法，其特征在于步骤（2）中所述反应总体积10μL为例，扩增体系中各组分的含量为：样品粗提总RNA 0.8μL，1×ThermoPol Buffer，4mM MgCl₂，0.8mM dNTP，0.8M Betaine，3.2U 的Bst DNA Polymerase，0.5U 的AMV Polymerase，1μM 的FIP和1μM 的BIP，0.2μM的F₃和0.2μM的B₃，补充DEPC水至10μL。