[发明专利]一种黄瓜绿斑驳花叶病毒的RT-LAMP快速检测试剂盒及检测方法

说明书

技术领域

本发明属于农业科学技术领域，涉及西瓜、黄瓜和葫芦等葫芦科植物上黄瓜绿斑驳花叶病毒的快速检测技术及其在病害诊断上的应用，具体涉及一种黄瓜绿斑驳花叶病毒的RT-LAMP快速检测试剂盒及检测方法。

背景技术

黄瓜绿斑驳花叶病毒（Cucumber green mottle mosaic virus，CGMMV）属番茄丛矮病毒科（Tombusviridae）、烟草花叶病毒属（Tobamovirus）成员。该病严重为害葫芦科作物，为我国的检疫性有害生物。黄瓜绿斑驳花叶病毒苗期染病幼苗顶尖部的2～3片叶子现亮绿或暗绿色斑驳，叶片较平，产生暗绿色斑驳的病部隆起，新叶浓绿，后期叶脉透化，叶片变小，引起植株矮化，叶片斑驳扭曲，呈系统性传染。瓜条染病现浓绿色花斑，有的也产生瘤状物，致果实成为畸形瓜，影响商品价值，严重的减产25%左右。自然界主要侵染甜瓜、西瓜、黄瓜、南瓜及瓠瓜等多种葫芦科作物，通过种子和土壤传播，此外也可通过汁液，农事操作及叶片接触等方式进行传播。带毒种子传播是该病毒远距离传播的主要途径。

该病自1935年被发现以来，曾先后在英国、德国、丹麦、荷兰、俄罗斯、印度、日本、韩国以及我国台湾发生并造成严重危害。黄瓜绿斑驳病毒病以前在我国大陆没有发生记载，2006年国内个别地方发现西瓜绿斑驳病毒病，2006年12月份中国农业部发布788号公告，将其列为全国植物检疫性有害生物。

目前在植物病毒鉴定识别上常采用的方法有：生物学实验，血清学检测，电镜观察及分子生物学检测。由于传统的植物病毒监测方法，如电镜观察、传统的生物学接种鉴定等这些方法很难分别出是否是黄瓜绿斑驳花叶病毒，因此需要一个快速准确的方法来检测该病毒。环介导恒温核酸扩增技术（Loop-mediated isothermal amplification,LAMP），是由Notomi 等在2000年发明的一种新颖的恒温核酸扩增方法，他是一种高灵敏度的链置换技术，一种新型的PCR替代技术。LAMP特点是针对靶基因的6个区域设计了4个特异引物，利用一种链置换DNA聚合酶—Bst DNA polymerase 在恒温的条件下反应60min就可以完成核酸扩增反应，通过荧光染色后在紫外光下观察可以清晰的观察到反应结果。不需要长时间的温度循环，不需要昂贵的PCR仪，不需要繁琐的电泳紫外观察等过程。目前已广泛应用于人类和动植物各种病毒、细菌、寄生虫等引起的疾病监测和快速诊断。但是，目前尚没有将RT-LAMP技术应用在黄瓜绿斑驳花叶病毒（CGMMV）的检测上。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于黄瓜绿斑驳花叶病毒快速检测的RT-LAMP引物组。

本发明的另一目的在于提供一种黄瓜绿斑驳花叶病毒RT-LAMP快速检测试剂盒。

本发明又一目的在于提供一种黄瓜绿斑驳花叶病毒的RT-LAMP快速检测方法。该方法用于快速检测西瓜、黄瓜和葫芦等葫芦科上黄瓜绿斑驳花叶病毒，通过该方法可以快速诊断出疑似病株是否携带黄瓜绿斑驳花叶病毒。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

一种用于黄瓜绿斑驳花叶病毒快速检测的RT-LAMP引物组，其在于所述的RT-LAMP引物组包含一对外引物和一对内引物，所述外引物对F3、B3的序列分别为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示，所述内引物对FIP、BIP的序列分别为SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示。

上述的引物组在制备黄瓜绿斑驳花叶病毒的快速检测试剂盒或检测试剂中的应用。

一种含有上述的引物组的黄瓜绿斑驳花叶病毒RT-LAMP快速检测试剂盒。

上述的黄瓜绿斑驳花叶病毒RT-LAMP快速检测试剂盒，其在于所述的试剂盒包含主要由植物病毒RNA快速提取液、RT-LAMP反应液、DEPC水和荧光染料SYBR GreenⅠ检测液组成的检测体系。