[发明专利]GFE-1与rmhTNFα的融合蛋白及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于医药生物技术领域，具体涉及一种肺小血管内皮特异性结合多肽GFE-1与重组改构人肿瘤坏死因子rmhTNFα的融合蛋白及其制备方法，以及该融合蛋白的表达、纯化及鉴定、体外活性检测及体内分布测定，以及对人肿瘤坏死因子的基因克隆、基因突变或重组改构、表达、鉴定等方面，还涉及利用所述融合蛋白制备抗肿瘤药物的方面。 

背景技术

1、肿瘤坏死因子相关研究 

肿瘤坏死因子α(TNFα)是一种由活化的单核细胞/巨噬细胞产生的具有多功能的炎症因子，一种多功能的细胞因子。肿瘤坏死因子α参与机体的免疫和代谢调节，对某些癌细胞具有增殖抑制和细胞毒作用，是迄今为止人们所知道的抗肿瘤活性最强的细胞因子。 

1.1肿瘤坏死因子α的生物学活性 

TNFα是一种具有多种功能的炎症因子，在体内外发挥抗瘤、抗炎、免疫调节等多种作用，以下主要介绍它抗肿瘤相关的生物学活性。 

TNFα体内外均能杀伤某些肿瘤细胞或抑制其增殖作用。TNFα可通过诱导某些癌细胞凋亡来抑制肿瘤。TNFα具有细胞毒活性，多种肿瘤细胞对其敏感。TNFα在体内外均能杀伤某些肿瘤细胞或抑制增殖作用。肿瘤细胞株对TNFα敏感性有很大的差异，某些因素可增加细胞对TNFα杀伤的敏感性，如IFN、高温、转录或翻译的抑制剂，有丝分裂的抑制剂，拓扑异构酶II抑制剂，蛋白激酶抑制剂以及LiCl等。用放线菌素D、丝裂霉素C、放线菌酮等处理肿瘤细胞（如小鼠成纤维细胞L929）可明显增强TNFα杀伤肿瘤细胞活性，此系统现在已经作为监测TNFα生物学活性的方法。 

在体内，TNFα还可以通过对机体免疫功能的调节作用，促进T细胞及其 他杀伤细胞对肿瘤细胞的杀伤。TNFα作为激发性细胞因子，可启动广泛的免疫炎性反应，介导天然细胞毒细胞、单核细胞和巨噬细胞，对癌细胞的杀伤和溶瘤作用。TNFα可作用于血管内皮细胞，对其增殖进行负调控，进而调节血管生成。并能启动血管损伤，引起肿瘤的血管内皮细胞损伤，不能调控血栓形成，从而导致肿瘤组织的局部血流阻断，发生出血性坏死或因营养缺乏而消退。 

TNFα的最大耐受剂量很低，因此常伴随发热、肌肉酸痛、流感样症状等副反应，严重限制了其临床应用。但是人们并没有停止对TNFα的研究，目前多通过构建变构体的形式以避免或减轻副作用、增加人体耐受性从而提高治疗效果。1.2TNFα的变构体 

TNFα活性三聚体的间沟是由近N端和近C端的极性基团及中部的疏水基团所组成的，而这些亚单位之间的沟是TNF与其受体结合的部位。实验表明，C端上最后一个氨基酸Leu157改变成Phe，met或者Glu，能提高其活性18倍左右，因为这种改变使疏水性的TNF-α亚单位之间的结构变得更紧凑，从而提高了TNFα同受体结合的效率。另外，缺失1-7个N端的氨基酸，增加了TNF-α的碱性度，提高了和受体的亲和力，活性增加了5倍。不仅如此，N端的8，9，10和17个氨基酸变成碱性氨基酸，使某些对野生型TNFα不敏感的细胞变得敏感了，扩大了TNFα的疗效范围，而且还增强了其抗肿瘤的活性。细胞水平和动物试验上的实验数据显示这些变构体不仅提高了同受体的结合能力，还增加了其摧毁肿瘤周围血管上皮组织的能力。另外，变构体引起的毒副作用也要比野生型TNFα低18倍。国内多家研究机构对TNFα变构体进行研究，已有多种TNFα变构体进入了临床研究阶段。 

发明人通过基因工程方法，将氨基端7个氨基酸残基去除，并将Pro⁸Ser⁹Asp¹⁰突变为Arg、Lys和Arg，同时把Leu¹⁵⁷突变为Phe，改构后的TNFα比天然TNFα体外杀伤L929细胞的活性增加1000倍左右，在体内肿瘤出血坏死效应也明显增加，比单独缺失N端七个氨基酸或者单独突变157位氨基酸的活性升高的都要大，且新型重组人肿瘤坏死因子毒性比天然肿瘤坏死因子降低三倍。原因是N端的氨基酸碱性增强可扩大抗瘤谱，而C端的最后一个氨基酸被替代，疏水性增强，使三聚体更为稳定。较天然肿瘤坏死因子活性提高了1000倍，而毒性却为天然肿瘤坏死因子的1/3。临床试验结果表明，rmhTNFα对非小细胞肺癌、黑色素瘤和头颈部肿瘤具有明显的治疗作用。已获得国家食品药品监督局的新药证书。 

2、特异性多肽研究现状