[发明专利]基于Allglo探针的中华按蚊击倒抗性基因突变位点的检测方法

权利要求书

1.一种检测中华按蚊击倒抗性基因突变位点的专用引物，其特征在于：由核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的引物1及引物2组成。

2.一种检测中华按蚊击倒抗性基因突变位点的试剂，其特征在于：由权利要求1所述专用引物、探针1、探针2及探针3组成，

所述探针1的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；

所述探针2的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；

所述探针3的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；

所述探针1的5’和3’末端均标记MAR基团；

所述探针2的5’和3’末端均标记JUP基团；

所述探针3的5’和3’末端均标记NEP基团。

所述探针1、探针2以及探针3核苷酸序列中的第7位碱基C以及探针2核苷酸序列中的第12位碱基T为锁核苷酸。

3.一种检测中华按蚊击倒抗性基因突变位点的反应试剂，其特征在于：由权利要求2所述试剂和Allglo反应缓冲液组成，所述反应试剂中，所述引物1和引物2的终浓度均为300～800nM，所述探针1、探针2以及探针3的终浓度均为200～600nM。

4.一种检测中华按蚊击倒抗性基因突变位点的试剂盒，其特征在于：包括权利要求3所述的反应试剂。

5.权利要求1所述专用引物或权利要求2所述试剂或权利要求3所述反应试剂或权利要求4所述试剂盒在检测中华按蚊击倒抗性基因突变位点以及制备中华按蚊击倒抗性基因突变位点检测产品中的应用，所述突变位点为L1014F或L1014C。

6.一种中华按蚊击倒抗性基因突变位点的检测方法，其特征在于步骤如下：取10～20μl权利要求3所述反应试剂或权利要求4所述试剂盒中的所述反应试剂，加入1条中华按蚊蚊腿进行Allglo探针实时荧光定量扩增，扩增结束，仪器自动进行扩增曲线分析，并根据扩增曲线进行结果判定；

所述扩增反应条件如下：

95℃预变性3～10min，95℃变性10～30s，60℃退火延伸20～60s，于所述退火延伸阶段采集信号，共35～45个循环；

所述结果判定标准如下：

仅FAM通道有扩增信号时，所述击倒抗性基因不含有所述突变位点，为TTG纯合野生型；

仅VIC/HEX通道有扩增信号时，所述击倒抗性基因存在L1014F突变位点，为TTT纯合突变型；

仅CY5通道有扩增信号时，所述击倒抗性基因存在L1014C突变位点，为TGT纯合突变型；

当FAM、VIC/HEX和CY5通道中任意两个有扩增信号时，所述击倒抗性基因为杂合型。

7.根据权利要求6所述中华按蚊击倒抗性基因突变位点的检测方法，其特征在于：所述杂合型为野生突变杂合型或突变杂合型，包括TTG/TTT野生突变杂合型、TTG/TGT野生突变杂合型或TTT/TGT突变杂合型。