[发明专利]基于Allglo探针的中华按蚊击倒抗性基因突变位点的检测方法

说明书

技术领域

本发明属于基因突变检测技术领域，具体涉及中华按蚊击倒抗性（kdr）基因突变位点的检测方法，尤其涉及基于Allglo探针的中华按蚊击倒抗性（kdr）基因突变位点的荧光定量PCR检测方法及试剂盒。

背景技术

中华按蚊(Anopheles sinensis)是我国主要的传疟媒介之一，近期相关报道指出我国中部地区的中华按蚊传播能力较上世纪有了大幅度提高，其传疟能力的增强可能与本世纪以来我国中部和黄淮地区疟疾疫情爆发有密切联系。使用杀虫剂进行按蚊媒介控制是非常重要的疟疾防治手段，人类应用杀虫剂防治蚊虫已有80年余年历史，自本世纪80年代初，用拟除虫菊酯类杀虫剂处理蚊帐及喷洒灭蚊逐渐成为重要的抗疟措施之一。由于多年来杀虫剂的大量使用，传疟媒介对杀虫剂的抗性在全球范围内迅速扩散。近几年我国湖北、江苏等中部省份的媒介抗性监测数据显示，当地中华按蚊对溴氰菊酯杀虫剂的抗性显著上升，湖北省部分地区中华按蚊对溴氰菊酯杀虫剂半数致死浓度（LC50）较1998年上升了306倍。

击倒抗性（kdr）是蚊虫对拟除虫菊酯类杀虫剂产生抗药性的分子机制之一，是由于昆虫钠离子通道蛋白第二结构域S6区段编码氨基酸序列发生突变所致，即kdr基因L1014位点（TTG）突变。研究发现，冈比亚按蚊中同时存在L1014F和L1014S突变，这些突变导致拟除虫菊酯类杀虫剂与钠离子通道蛋白上的结合位点发生变化，与杀虫剂的结合能力变弱，从而对其敏感性降低（D.Martinez-Torres，F.Chandre，M.S.Williamson，et al.．Molecular characterization of pyrethroid knockdown resistance(kdr)in the major malaria vector Anopheles gambiae s.s[J]．Insect Mol Biol，1998，7（2）：179-184；J.Pinto，A.Lynd，N.Elissa，et al.．Co-occurrence of East and West African kdr mutations suggests high levels of resistance to pyrethroid insecticides in Anopheles gambiae from Libreville,Gabon[J]．Med Vet Entomol，2006，20（1）：27-32）；2007年，KimH等报道了中华按蚊kdr基因存在L1014F（TTT）和L1014C（TGT）两种突变型，突变后中华按蚊对溴氰菊酯敏感性明显降低（H.Kim，J.H.Baek，W.-J.Lee，et al.．Frequency detection of pyrethroid resistance allele in Anopheles sinensis populations by real-time PCR amplification of specific allele (rtPASA)[J]．Pesticide Biochemistry and Physiology，2007，87（1）：54-61）。因此，不同地区蚊虫击倒抗性相关基因突变频率的测定可为传疟媒介防制措施的制定提供科学依据。

目前已有采用PCR和TaqMan法荧光定量PCR检测中国按蚊抗药性kdr基因突变的报道。2011年，武松等报道了中华按蚊击倒抗性突变PCR检测方法的建立（武松，马尔健，刘茜等.中华按蚊击倒抗性突变PCR检测方法的建立[J].中国人兽共患病学报,2011,27(11):1008-1010）；中国专利CN102373280A和CN102373282A分别公开了一种中华按蚊抗药性AS-PCR检测试剂盒以及PCR-RFLP检测试剂盒，但上述PCR方法需开盖检测结果，易引起交叉污染和假阳性，需依据电泳条带强弱进行结果判定，降低试验敏感性和特异性，易错判误判，同时在电泳中需使用毒性EB染液，不利于操作人员健康；中国专利CN102373281A公开了一种中华按蚊抗药性TaqMan PCR检测试剂盒，但TaqMan探针合成复杂，价格昂贵，需在两管内用不同的TaqMan探针组合分别进行荧光定量扩增，操作和检测程序较繁琐，且检测敏感性和特异性还有待提高；此外，上述方法均需预先提取按蚊基因组DNA作为扩增模板，费时费力，检测效率低，易污染。

在现场媒介监测中，迄今尚缺乏敏感性和特异性高、成本低、简便快速的中华按蚊kdr基因突变检测方法及相应试剂和试剂盒。

发明内容