[发明专利]一种贴壁分选卵巢肿瘤侧群细胞的方法

说明书

技术领域

本发明属于细胞生物学领域，涉及肿瘤干细胞研究，具体涉及一种贴壁分选卵巢肿瘤侧群细胞的方法。该方法从卵巢肿瘤细胞系中分选出一群具有干细胞样特性的细胞，即侧群细胞(SP cells，side population cells)，能够简化实验过程和节约时间，提高分选时的细胞活性。

背景技术

现有技术公开了肿瘤干细胞是一群具有自我更新和分化能力的具有干样特性的细胞，目前，公认的肿瘤干细胞的分选方法包括表面标志物的分选，如CD133+、CD44+CD117+以及ALDHbr(aldehyde dehydrogenase bright)等，另外还有侧群细胞的分选，即SP细胞分选。肿瘤干细胞中高表达ABC转运蛋白的细胞能够通过流式鉴定。卵巢肿瘤的SP细胞分选方法的基础就在于这一小群细胞高表达ABC转运蛋白，能够拒染Hoechst33342。上述两种方法中，其中的表面标志物的分选方法，迄今尚未发现有较为明确的肿瘤干细胞的表面标志物的报道；所述的侧群细胞的分选方法，作为传统的实验方法存在有如下缺陷：实验操作较为繁琐，耗时耗力。因此，本研究领域迫切需要简化卵巢肿瘤SP细胞分选的方法以达到提高实验效率的目的。

与本发明相关的现有技术有：

1.Dou J，Jiang C，Wang J，Zhang X，Zhao F，Hu W，He X，Li X，Zou D，Gu N.Using ABCG2-molecule-expressing side population cells to identify cancer stem-like cells in a human ovarian cell line.Cell Biol Int2011；35：227-234.

2.Hiraga T，Ito S，Nakamura H.Side population in MDA-MB-231human breast cancer

cells exhibits cancer stem cell-like properties without higher bone-metastatic potential.Oncol Rep2011；25：289-296.

3.Goodell MA.Stem cell identification and sorting using the Hoechst33342side population(SP).Curr Protoc Cytom2005；9：18.

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种简化的从卵巢肿瘤细胞系中分选具有干细胞样特性细胞的新方法，尤其涉及一种贴壁分选卵巢肿瘤侧群细胞的方法。

本发明方法，可明显节省实验流程操作时间(30分钟左右)，且随着分选细胞总数的增加相应节约的时间更多，效率提高，存活细胞比例增加，使劳动力成本明显下降。

具体的，本发明的一种贴壁分选卵巢肿瘤侧群细胞的方法，其特征在于，不需要酶解消化过程，细胞直接在贴壁的状态下进行孵育染色，完成染色后再将细胞酶解成单细胞，在悬浮状态上机分选，获得与传统方法无差异的SP细胞比例。

本发明对传统分选SP细胞的方法进行了改进，现有技术的分选SP细胞的方法的技术方案中(Goodell等在2005年公开的SP细胞分选方法)，对贴壁培养的细胞进行染色时，需要先采用胰酶消化，使细胞悬浮后再进行染色，且所采用的Hoechst33342染色后孵育至少需要90分钟，每10-15分钟需要振荡混匀一次等的技术方案；

本发明中，简化了卵巢肿瘤SP细胞分选过程，贴壁生长的细胞不需消化悬浮，也不必在孵育过程中不停地振荡混匀，最后洗弃培液直接重悬无需反复洗涤离心，减少了对细胞活性损害。

本发明中，实验所采用的孵育液为改良的孵育液，该孵育液可有效的用于贴壁培养的卵巢肿瘤细胞系的SP细胞分选；所述的改良的人卵巢肿瘤细胞系SP细胞分选孵育液由如表1所述的成分组成。

表1显示了改良的人卵巢肿瘤细胞系SP细胞分选孵育液的成分与配比。表1

更具体的，本发明的贴壁分选卵巢肿瘤侧群细胞的方法，其特征在于，其包括步骤：

1)分别进行人卵巢肿瘤细胞系ES-2、OVCAR-3细胞培养，