[发明专利]一种采用两阶段pH控制发酵生产α-酮戊二酸的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物工程领域，涉及发酵过程控制，特别是一种两阶段pH控制策略，应用于α-酮戊二酸的发酵法生产。

背景技术

α-酮戊二酸(α-Ketoglutaric acid，α-KG)，也称2-氧代戊二酸或α-羰基戊二酸，是分子式为C₅H₆O₅、相对分子质量为146.1的白色或微黄色的结晶。作为三羧酸循环(TCA)和氨基酸代谢的重要中间产物之一，α-酮戊二酸参与生物体内氨基酸、维生素和有机酸的合成及能量代谢。迄今为止，α-酮戊二酸已被广泛应用于化工、食品、医药、日化等领域，由此可见，该化合物具有非常广泛的应用前景。其化学结构式为：

α-酮戊二酸化学结构式

随着α-酮戊二酸应用范围在不断扩大，其市场需求也在不断增长，而目前市场上α-酮戊二酸的生产主要是通过化学合成的。主要以丁二酸二乙酯、草酸二乙酯等为原料，合成α-酮戊二酸，具有收率高、副产物少、反应条件温和、易于工业化放大等优点。但是在原料来源和安全生产上存在一定的问题，主要存在爆炸的危险，此外，化学合成对环境污染大以及生产过程中对人的身体危害十分大。因此，利用微生物发酵法生产α-酮戊二酸具有重要的意义。

对于利用微生物发酵生产α-酮戊二酸的研究，最早见于1946年，Lockwood和Stodola用细菌生物合成α-酮戊二酸。之后，Asai等人利用假单胞杆菌、产气杆菌和粘质沙雷氏菌过量合成α-酮戊二酸，并且提出过量合成α-酮戊二酸的必要条件是培养基中碳氮比。

目前国内对发酵法生产α-酮戊二酸的研究较少。江南大学陈坚等人筛选的解脂亚洛酵母（Yarrowia lipolytica WSH-Z06），液态发酵6天，α-酮戊二酸产量达39.3g/L。

发明内容

本发明目的是克服现有技术中存在的上述不足，提供一种采用两阶段pH控制发酵生产α-酮戊二酸的方法。

本发明提供的采用两阶段pH控制发酵生产α-酮戊二酸的方法是：以谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)GKG-047（保藏号CGMCC No.5481，已在2011103927788号专利申请中提交保藏证明并公开）为生产菌株，采用两阶段pH控制，发酵前期以NH₃·H₂O调节pH在7.0～7.2，待菌株由生长型转变至产酸型后用NaOH调节，pH仍维持在7.0～7.2，使其处于最佳产酸环境。

具体方法如下：以谷氨酸棒状杆菌为出发菌株，接种至活化斜面，32℃培养12～14h，用接种环刮取斜面菌种接种至种子培养基，32℃，200rpm培养7～8h；按10%的接种量转接至装有发酵培养基的发酵罐中，34℃，溶氧维持在30以上（优选30%～40%），用NH₃·H₂O调节pH使其维持在7.0～7.2之间，开始发酵；待发酵液中的细胞形态开始转变，由生长型细胞转变为产酸型细胞时，将NH₃·H₂O替换成质量浓度为20%～25%的NaOH，pH依然维持在7.0～7.2之间。

其中：

⑴斜面培养基成分以g/L计：蛋白胨10，酵母粉5，NaCl2.5，琼脂30，pH7.0～7.2；

⑵种子培养基成分：口服葡萄糖25g/L，玉米浆45mL/L，豆粕水解液30mL/L，K₂HPO₄·3H₂O2.2g/L，MgSO₄·7H₂O0.9g/L，NH₃NO₃6g/L，尿素3g/L；

⑶液体发酵培养基成分：口服葡萄糖80g/L，Na₂HPO₄·12H₂O3.85g/L，V_B10.4mg/L，MgSO₄·7H₂O2g/L，MnSO₄5mg/L，FeSO₄5mg/L，ZnSO₄5mg/L，KCl1.333g/L，玉米浆3mL/L，糖蜜1.1g/L，豆粕水解液10mL/L。

本发明方法在长菌阶段菌种利用葡萄糖快速生长，形成菌体，不形成各种副产物有机酸，转型后的产酸阶段，菌体保持较高活性，利用葡萄糖合成α-酮戊二酸，几乎不形成其他有机酸。