[发明专利]用于制备牛口蹄疫O型肽疫苗的多肽及其制备方法和用途

权利要求书

1.一种用于制备牛口蹄疫O型肽疫苗的多肽，其特征在于，所述多肽包含如SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述多肽还包含具有增强免疫作用的口蹄疫内源或外源性T细胞表位氨基酸序列，其中，所述氨基酸序列选自SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 4中的一个或多个；

优选地，所述多肽包含如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO. 6或SEQ ID NO. 7所示的氨基酸序列。

3.根据权利要求2所述的多肽，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO. 6或SEQ ID NO. 7所示；

优选地，所述多肽的氨基酸序列中的两个半胱氨酸的巯基经氧化连接在一起形成二硫键；

进一步优选地，所述多肽的氨基酸序列的首尾氨基酸残基之间反应形成共价连接；

更优选地，所述多肽的氨基酸序列的首尾氨基酸残基的羧基与氨基、或者羧基与羟基之间反应形成共价连接。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的多肽的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：

（1）以氨基树脂为起始原料，以由9-芴甲氧羰基保护的氨基酸为单体，按照所述氨基酸序列依次缩合接上氨基酸以合成所述多肽，每步缩合反应后用乙酰咪唑封闭未反应的氨基端；

（2）合成完毕后加入裂解试剂，从而将所述多肽从氨基树脂上裂解下来；

（3）使用乙醚沉淀所述多肽；和

（4）对所述多肽进行超滤纯化，然后进行无菌处理。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）包括以下步骤：

（1-a）脱保护反应：将氨基树脂置于体积百分比为15-30%的六氢吡啶的N-甲基吡咯烷酮溶液中，在20-28℃条件下反应25-40分钟，从而脱除氨基树脂上的9-芴甲氧羰基保护基团；

（1-b）洗涤：氮气吹干，然后用N-甲基吡咯烷酮洗涤氨基树脂；

（1-c）缩合反应：加入1-羟基苯丙三唑、二环己基碳二亚胺与由9-芴甲氧羰基保护的氨基酸，然后在20-28℃条件下反应0.5-2.5小时；

（1-d）洗涤：氮气吹干，然后用N-甲基吡咯烷酮洗涤氨基树脂；和

（1-e）封闭反应：加入重量体积百分比为1.5-4%的乙酰咪唑的N-甲基吡咯烷酮溶液，在20-28℃条件下反应20-40分钟。

6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中裂解试剂的组分为体积比为85：8：6：1的三氟乙酸：三异丙基硅烷：苯酚：H₂O；

优选地，所述步骤（2）的裂解时间为1-4小时。

7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法的步骤（3）中还包括：

（3-a）使用乙醚沉淀所述多肽，然后用二甲基甲酰胺洗涤；

（3-b）在加入占反应体系总体积10%的二甲基亚砜情况下，使沉淀得到的多肽的氨基酸序列中两个半胱氨酸之间形成二硫键；和

（3-c）使所述多肽的氨基酸序列的首尾氨基酸残基之间反应形成共价连接；优选地，在加入占反应体系总体积1%的二异丙基碳二亚胺和0.5%的1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑情况下使所述多肽的氨基酸序列的首尾氨基酸残基的羧基与氨基、或者在加入0.1M H₂SO₄情况下使羧基与羟基之间反应形成共价连接。

8.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（4）包括以下步骤：

（4-a）使用切向过滤膜包在20-28℃条件下超滤所述多肽，从而除去小分子杂质；和

（4-b）使用0.2微米在线滤器除菌保存。

9.一种牛口蹄疫O型肽疫苗，其特征在于，所述肽疫苗包含一种或多种根据权利要求1至3中任一项所述的多肽。

10.根据权利要求9所述的肽疫苗，其特征在于，所述肽疫苗还包含佐剂；

优选地，所述佐剂为选自白油、50V、50VII中的一种或多种；

进一步优选地，所述肽疫苗中所包含的多肽和佐剂的体积比为1:1。