[发明专利]一株伯克霍尔德氏菌及利用该菌发酵合成PHA的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一株聚羟基脂肪酸酯合成菌伯克霍尔德氏菌(Burkholderia sp.)CG-01及利用该菌通过两步发酵法合成聚羟基脂肪酸酯(PHA)的方法。

背景技术

聚羟基脂肪酸酯(PHA)是某些原核微生物在失去营养平衡时，即氮源缺失、碳源丰富的情况下，在体内合成并积累的贮存碳源和氮源的颗粒状物质；在环境条件恢复平衡的情况下，PHA又可被微生物分解利用，对环境没有污染，属于生物可降解性材料。

聚羟基脂肪酸酯(PHA)，是很多微生物体内合成的一种细胞内线性聚酯，是一种天然的高分子生物材料，PHA不仅具有良好的生物相容性、生物可降解性和可塑性，并被应用到生物医用材料和生物可降解包装材料，更有着非线性光学性、压电性、气体隔离性等很多高附加值性能。

PHA的生产是一种低能耗和低二氧化碳排放的生产，不仅对于环境保护、促进工业与环境和谐发展有着重要意义，而且使PHA的工业化扩大生产提供了可能性，有着十分重要的应用意义。然而，目前制约PHA规模化应用的主要原因是制备成本高，其经济性无法与石油基材料抗衡。因此，必须设法得到高产菌株，降低PHA生产成本，提高PHA规模化应用的可能性。

发明内容

本发明的目的之一是提供一株新发现的聚羟基脂肪酸酯合成菌伯克霍尔德氏菌(Burkholderia sp.)CG-01。

本发明的聚羟基脂肪酸酯合成菌伯克霍尔德氏菌(Burkholderia sp.)CG-01分离自天津市南开大学生物楼前的丁香树根系土壤。该菌在LB培养基上生长良好。LB培养基的组成为蒸馏水1000ml，蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl5g，pH7.0-7.2。菌落呈圆形半透明，表面突起，质地光滑，边缘整齐。其16S rDNA基因的核苷酸序列长度为1424bp。使用BLAST对伯克霍尔德氏菌(Burkholderia sp.)CG-01的16S rDNA基因和GenBank中已登录细菌进行同源性比对，发现该株菌与已报道的伯克霍尔德氏菌(Burkholderia)的16S rDNA基因序列相似性最高。于是，命名该菌为伯克霍尔德氏菌(Burkholderia sp.)CG-01。该菌已于2013年3月19日保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为：CGMCC No.7329。

伯克霍尔德氏菌(Burkholderia sp.)CG-01，CGMCC No.7329的系统进化树见说明书附图1。

本发明的另一个目的是公开利用上述们克霍尔德氏菌(Burkholderia sp.)CG-01，CGMCCNo.7329菌株以单一碳源——葡萄糖大量合成聚羟基脂肪酸酯的方法。

本发明采取以下技术方案：将菌种接种到5ml种子培养基，30℃下摇床振荡培养，转速120rpm；培养11-13小时后，按照5％的接种量接种到200ml发酵合成培养基中，30℃摇床振荡培养，转速150rpm；培养24小时后，菌液离心，磷酸缓冲溶液洗涤，再离心，离心后的菌体全部转入200ml PHA发酵合成培养基中，转速120-180rpm，30℃下摇瓶发酵36-72小时；离心发酵液，弃上清，收集菌体冷冻干燥；将干燥菌体转入100ml三角瓶中，按25ml/g的量加入氯仿充分搅拌48小时，过滤去除菌体残渣，将滤液旋转蒸发浓缩后，加入浓缩后剩余物40倍体积的冷甲醇沉淀PHA产物过夜，收集沉淀，真空干燥，保存，称重。

该菌株伯克霍尔德氏菌(Burkholderia sp.)CG-01，CGMCC No.7329能以单一碳源——葡萄糖大量合成聚羟基脂肪酸酯PHB，即聚3-羟基丁酸酯。

本发明与现有技术相比具有的突出优点：以该菌合成聚羟基脂肪酸酯PHA尚属首次报道；野生的伯克霍尔德氏菌CG-01，CGMCC No.7329能以葡萄糖为碳源合成PHB，在未经优化的条件下，PHB含量占菌体干重达37.55％；由于该菌株能在超过100余种碳源的培养基上生长，这为今后进一步优化发酵条件，提高收率，降低PHA生产成本留有很大的发展空间。

附图说明

图1是伯克霍尔德氏菌(Burkholderia sp.)CG-01，CGMCC No.7329的系统进化树。

下面结合具体实例对本发明做进一步说明。

具体实施方案

在下面的实施例中，所用菌种均为伯克霍尔德氏菌(Burkholderia sp.)CG-01，CGMCC No.7329。实施例中所用的不同培养基配方如下：

(1)分离培养基