[发明专利]一种制备多能性干细胞的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种制备多能性干细胞的方法，具体地说，涉及一种利用可调控的蛋白稳定系统制备多能性干细胞的方法。

背景技术

1981年Evans和Matin两位科学家同时成功地分离出小鼠ES细胞，即胚胎干细胞，由于其无限增殖及其潜在的分化能力，使其广泛用于基础研究和应用。特别是1998年Thomason等首次利用临床上自愿捐献的体外受精—胚胎移植(in-vitro fertilization and embryo transfer,IVF-ET)胚胎建立了5个人胚胎干细胞系，掀起了细胞治疗的热潮。同时与基因打靶技术结合，使其在细胞发育机制研究、细胞代替治疗、新药制备与筛选、器官移植等领域具有巨大的应用前景。但是人的ES细胞涉及伦理问题，大大限制了未来应用。为了解决这个问题，2006年日本科学家Yamanaka，成功利用四个转录因子Oct4、Klf4、Sox2、c-Myc将小鼠胎儿成纤维细胞诱导成为与ES细胞类似的多能性干细胞，并且命名为iPS细胞即诱导多能性干细胞。此技术的发展为未来细胞治疗开启了一片新天地。但是由于外源因子整合及c-Myc的致癌性，对安全性造成威胁。

为了解决安全性问题，研究者开发了Doxycycline(Dox)诱导iPS系统。但此系统具有以下缺点，第一，有低水平的漏表达；第二，需要持续表达额外元件tTA或rtTA。同时此系统在mRNA水平调控，不能准确反应内源蛋白的表达情况，因此很多方面亟待改进。

发明内容

本发明的目的是提供一种制备多能性干细胞的方法，特别是涉及一种利用可调控的蛋白稳定系统制备多能性干细胞的方法。

为了实现本发明目的，本发明提供了一种新的诱导系统，该系统不利用原癌基因c-Myc，它是一种由TMP诱导的安全的三因子诱导iPS系统。TMP是一个蛋白诱导系统，原理是通过将蛋白降解信号融合到目的蛋白上，然后通过磺胺类药物TMP对蛋白稳定性进行调控。加入TMP，则目的蛋白表达，去除TMP，则外源蛋白降解。

本发明首先提供一种TMP调控系统表达载体，其是以piggyBac转座子载体为骨架载体，所述表达载体包括从ZGs载体（Seq ID No.6）上获得的PB5′端和PB3′端，采用单顺反子读码框架，以启动子EF1α启动转录，三个外源基因OCT4、KLF4和SOX2之间由2A序列连接，DD基因位于上述至少一个外源基因的5′端，转座酶载体PBase中含有CAG启动子；其中，所述DD基因为带有R12Y和Y100I突变的大肠杆菌二氢叶酸还原酶基因，并根据人的密码子偏好性进行了优化。

优选地，前述TMP调控系统表达载体的核苷酸序列如Seq ID No.1所示。

优选地，前述TMP调控系统表达载体的核苷酸序列如Seq ID No.2所示。

优选地，前述TMP调控系统表达载体的核苷酸序列如Seq ID No.3所示。

本发明还提供一种制备多能性干细胞的方法：将上述TMP调控系统表达载体导入胚胎成纤维细胞中，所得阳性细胞克隆经磺胺类药物TMP处理后接种饲养层细胞，通过培养传代，获得多能性干细胞。

优选地，所述胚胎成纤维细胞为小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）等。

前述方法中，向细胞培养基中加入磺胺类药物TMP的浓度为1μM。

本发明公开了利用一种可调控的蛋白稳定系统制备多能性干细胞的方法，该方法是将目的载体待调控因子前加上降解区域。当在外源OCT4前添加降解区域时，通过添加TMP，可稳定待调控因子蛋白，并获得诱导的多能性干细胞，不添加TMP，则不能获得多能性干细胞克隆；通过改变TMP的添加剂量和添加时间，可以控制外源因子的表达计量及表达阶段，从而得到不同的多能性细胞诱导效率。本发明的方法为诱导多能性细胞的获取提供了一个可调控的途径。

本发明提供的可调控的蛋白稳定系统系统具有以下优点：

（一）快速敏感调控，即短时间内即可对目的蛋白进行调控，同时1μM的TMP就可以稳定目的蛋白。

（二）使用方便。由于不像Dox系统还需要额外的元件，TMP只需要一个蛋白降解元件，然后融合到目的蛋白上即可。

（三）可以对多个目的蛋白进行调控。可以将蛋白降解元件分别与目的蛋白融合然后进行多基因调控。