[发明专利]一种发酵生产吡咯喹啉醌过程中消除副产物多糖的方法及其应用

权利要求书

1.一种发酵生产吡咯喹啉醌过程中消除副产物多糖的方法，其特征在于，该方法是在微生物发酵生产吡咯喹啉醌的过程中，通过基因敲除手段敲除吡咯喹啉醌生产菌株多糖合成基因簇中的重要基因，使该生产菌株丧失了胞外多糖合成的能力，而不降低该生产菌株生产吡咯喹啉醌的能力。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生产菌株为甲基营养菌Methylovorus sp.MP688；所述多糖合成基因簇中的重要基因为磷酸转移酶类。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述磷酸转移酶类为mpq_1844。

4.根据权利要求1～3任意一项所述的方法，其特征用于，所述方法的具体步骤为：

（1）筛选吡咯喹啉醌生产菌株多糖合成基因簇中的重要基因；

（2）提取所述PQQ生产菌株的基因组DNA，并设计引物，以该基因组DNA为模板，通过PCR方法扩增步骤（1）所述重要基因5’端和3’端的侧翼序列；

（3）将步骤（2）所得5’端侧翼序列和3’端的侧翼序列分别作双酶切处理，连接到基因敲除载体上；

（4）步骤（3）所述基因敲除载体通过常规电转化或者接合转移的方式导入所述PQQ生产菌株中，在含有氨苄青霉素的MP固体培养基上培养，挑取抗性单菌落在无筛选条件下传代2-4次，通过反筛标记筛选含有蔗糖的培养基平板上的阳性克隆，进而通过菌落PCR鉴定重要基因是否缺失；

（5）在摇瓶中进行基因缺失菌和原始生产菌株的PQQ发酵实验，分别取发酵液离心，观察菌体表面形态，鉴定细菌表面不溶性多糖的有无，测定上清液中可溶性胞外多糖的含量。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤（1）所述筛选吡咯喹啉醌生产菌株多糖合成基因簇中的重要基因的方法是在NCBI gene bank数据库中下载多糖合成途径中的重要基因序列，其中，所述重要基因为磷酸转移酶类mpq_1844及其侧翼序列，所述mpq_1844的核苷酸序列如SEQ.ID No.1所示，所述侧翼序列的核苷酸序列如SEQ.ID No.2和SEQ.ID No.3所示。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述设计引物包括正向和反向两条引物，具体为：5’端侧翼序列正向引物UpF如SEQ.ID No.4所示，反向引物UpR如SEQ.ID No.5所示；3’端的侧翼序列正向引物DwF如SEQ.IDNo.6所示，反向引物DwR如SEQ.ID No.7所示。

7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤（3）中所述双酶切处理，具体为：5’端侧翼序列用ApaI和BamHI双酶切处理；3’端的侧翼序列用SpeI和NotI双酶切处理；所述的基因敲除载体为质粒pWM91。

8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤（4）中所述的氨苄青霉素的终浓度为50μg/mL；所述反筛标记为sacB；所述培养基中所使用的蔗糖浓度为0.01～0.05g/mL。

9.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤（5）中所述可溶性多糖测定方法为苯酚-硫酸法；所述的离心转速和时间，具体为10000-12000转/分、5-10分钟。

10.权利要求1～3任意一项所述方法在微生物发酵生产辅酶或维生素过程中的应用。