[发明专利]一种发酵生产吡咯喹啉醌过程中消除副产物多糖的方法及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及微生物发酵技术和基因工程技术领域，具体的涉及一种发酵生产吡咯喹啉醌过程中消除副产物多糖的方法及其应用。

背景技术

吡咯喹啉醌（Pyrroloquinoline quinone，PQQ）是由第三类氧化还原酶的辅酶，具有多种生理功能和潜在的药用价值。文献报道，甲基营养菌PQQ合成水平较高，且具有清洁低碳、温和可控、成本低廉等优势，是一种极具潜力的生产菌株。然而多数甲基营养菌具有合成胞外多糖的能力，限制了微生物发酵生产PQQ大规模应用，多糖的主要不利因素有：（1）细菌分泌可溶性多糖不仅造成纯化柱堵塞影响纯化效率，而且会缩短纯化介质的使用寿命；（2）发酵液的粘度增大影响发酵过程中的氧传递效率；（3）不溶性多糖附着在细菌表面使发酵液胞外组分和菌体的分离效果不佳，增加动力成本。

细菌中多糖的合成包括一系列生化反应，编码这些反应的酶的基因一般以基因簇的形式存在，因此阻断细菌多糖合成途径的方法之一就是对多糖合成的重要基因进行敲除，达到在不影响细菌生长和目标代谢产物合成的前提下，在一定水平上降低或者去除多糖的目的。截至目前，通过这种遗传改造消除细菌发酵中产生的多糖的方法和应用未见报道。

发明内容

为了解决上述问题，本发明的目的是提供一种发酵生产吡咯喹啉醌过程中消除副产物多糖的方法，为简化利用微生物大规模生产PQQ的纯化工艺奠定了基础。

本发明的另一目的提供上述方法在微生物发酵生产辅酶或维生素过程中的应用。

为了实现上述发明目的，本发明的技术方案如下：

一种发酵生产吡咯喹啉醌过程中消除副产物多糖的方法，该方法是在微生物发酵生产吡咯喹啉醌的过程中，通过基因敲除手段敲除吡咯喹啉醌生产菌株多糖合成基因簇中的重要基因，使该生产菌株丧失了胞外多糖合成的能力，而不降低该生产菌株生产吡咯喹啉醌的能力。

优选的，所述生产菌株为甲基营养菌Methylovorus sp.MP688。该菌已于2010年8月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号为CGMCCNo.4096。

优选的，所述多糖合成基因簇中的重要基因为磷酸转移酶类的基因，如mpq_1844。

上述的方法的优选的具体步骤为：

（1）筛选吡咯喹啉醌生产菌株多糖合成基因簇中的重要基因；

（2）提取所述PQQ生产菌株的基因组DNA，并设计引物，以该基因组DNA为模板，通过PCR方法扩增步骤（1）所述重要基因5’端和3’端的侧翼序列；

（3）将步骤（2）所得5’端侧翼序列和3’端的侧翼序列分别作双酶切处理，连接到基因敲除载体上；

（4）步骤（3）所述基因敲除载体通过常规电转化或者接合转移的方式导入所述PQQ生产菌株中，在含有氨苄青霉素的MP固体培养基上培养，挑取抗性单菌落在无筛选条件下传代2-4次，通过反筛标记筛选含有蔗糖的培养基平板上的阳性克隆，进而通过菌落PCR鉴定重要基因是否缺失；

（5）在摇瓶中进行基因缺失菌和原始生产菌株的PQQ发酵实验，分别取发酵液离心，观察菌体表面形态，鉴定细菌表面不溶性多糖的有无，测定上清液中可溶性多糖的含量。

优选的，步骤（1）所述筛选吡咯喹啉醌生产菌株多糖合成基因簇中的重要基因的方法是在NCBI gene bank数据库中下载多糖合成途径中的重要基因序列（具体网址为：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_014733.1?from=1899875&to=1901296&report=fasta），更优选为，磷酸转移酶类mpq_1844及其侧翼序列，所述mpq_1844的核苷酸序列如SEQ.ID No.1所示，所述侧翼序列的核苷酸序列如SEQ.ID No.2和SEQ.ID No.3所示，所述的侧翼序列长度，优选1500-2500bp。