[发明专利]鱼源链球菌脉冲场凝胶电泳快速分型方法

权利要求书

1.一种鱼源链球菌脉冲场凝胶电泳快速分型方法，采用从鱼源上分离并培养得到的链球菌作为分析样品，其特征是，包括以下工艺步骤：

（1）胶块制备：

（1-1）、将链球菌样品在血平板培养基上培养18～24小时后，用无菌接种环刮取单菌落重悬于2ml的TE缓冲液中，得到细菌悬浊液，调整细菌悬浊液的OD值为3.6～4.5；

（1-2）、取160～185μL细菌悬浊液于1.5ml离心管中，加入5～10μL浓度为10mg/ml的溶菌酶，混合均匀；将细菌悬浊液与溶菌酶的混合溶液置于37℃水浴中孵育15～30分钟；从水浴中取出离心管，加入5～10μL浓度为20mg/ml的蛋白酶K和5～20μL浓度为1mg/ml的变溶菌素；

（1-3）、将TBE缓冲液和低熔点琼脂糖混合，每100ml TBE缓冲液中加入1～1.5g低熔点琼脂糖，得到凝胶溶液；将凝胶溶液放置在42～45℃的水浴中平衡，备用；

（1-4）、将200μL凝胶溶液加入步骤（1-2）得到的细菌悬浊液中，混合均匀；

（1-5）、将步骤（1-4）得到的混合物加入成胶模具进行凝固，避免气泡产生，在室温下凝固15分钟，得到胶块；

（2）细胞裂解：

（2-1）、配制细胞裂解液：将1.5ml的ES缓冲液加入到50～75μL浓度为20mg/ml的蛋白酶K中，混合均匀，得到细胞裂解液；将细胞裂解液置于冰上，备用；

（2-2）、将1.5ml细胞裂解液加入到2ml的螺旋盖离心管中；

（2-3）、将步骤（1-5）得到的胶块放入步骤（2-2）的螺旋盖离心管中，用刀片削去成胶模具表面多余的胶块，并保证胶块在液面以下，不与离心管的管壁接触；

（2-4）、将步骤（2-3）的螺刻盖离心管放置在54～56℃水浴摇床中孵育90～120min，摇床转速为120～170转/分钟；

（3）洗胶块：

（3-1）、将TE缓冲液和纯水放置在50℃的水浴摇床中预热，备用；

（3-2）、将步骤（2-4）处理后的螺旋盖离心管从水浴摇床中拿出，盖上滤筛盖，倒掉螺旋盖离心管中的细胞裂解液；将胶块转移至5ml的螺旋盖离心管中，向该5ml的螺旋盖离心管中加入4ml经步骤（3-1）预热后的纯水，确保胶块位于液面以下，将螺旋盖离心管放回50℃水浴摇床中摇10～15分钟，水浴处理结束将螺旋盖离心管中的纯水倒掉；再次向螺刻盖离心管中加入4ml步骤（3-1）预热后的纯水，50℃水浴摇床中摇10～15分钟，水浴处理后将螺旋盖离心管中的纯水倒掉；

（3-3）、向步骤（3-2）处理后的胶块中加入4ml经步骤（3-1）预热后的TE缓冲液，再在50℃的水浴摇床中摇10～15分钟，倒掉TE缓冲液；

（3-4）、重复步骤（3-3）2～3次后，向胶块中加入4ml的TE缓冲液，放置在4℃的冰箱中保存备用；

（4）胶块内DNA的酶切：

（4-1）、配制酶缓冲稀释液：将180μL纯水与20μL的Sma I限制性内切酶10×缓冲液混合，得到200μL酶缓冲稀释液；

（4-2）、在1.5ml离心管中加入200μL酶缓冲稀释液；

（4-3）、将步骤（3-4）得到的胶块放在培养皿上，切成2mm宽的小胶块，将小胶块放入步骤（4-2）的离心管中，确保小胶块处在液面以下，并将离心管放在冰上孵育10～15分钟；

（4-4）、配制Sma I限制性内切酶的缓冲液：将174μL纯水、2μL浓度为1mg/ml的牛血清蛋白、20μL的Sma I限制性内切酶10×缓冲液和40U的Sma I限制性内切酶混合，得到200μL的Sma I限制性内切酶的缓冲液；

（4-5）、向经步骤（4-3）孵育后的离心管中加入200μL的Sma I限制性内切酶的缓冲液，保证小胶块位于液面以下，常温孵育3～5小时；

（5）加样：

（5-1）、使电泳梳子齿与胶槽的底面距离为1～2mm，调整胶槽至水平位置；

（5-2）、倒掉步骤（4-5）所述离心管中的Sma I限制性内切酶缓冲液，并向离心管中加入200μL的TBE缓冲液，备用；

（5-3）、将电泳梳子平放在胶槽上，把步骤（5-2）所述离心管中的小胶块取出加在电泳梳子齿上，用吸水纸边缘吸去小胶块周围的液体，在室温下风干3～5分钟；

（5-4）、将步骤（5-3）加过样的电泳梳子放入胶槽，确保电泳梳子齿上所有的胶块在一条直线上，并且胶块与胶槽的底面距离为1～2mm；从胶槽的下部中央缓慢倒入100ml温度为50～60℃的脉冲场琼脂糖溶液，避免气泡的生成，再在室温下凝固20～30分钟；所述脉冲场琼脂糖溶液由1g脉冲场琼脂糖加入100ml的TBE溶液中得到；

（6）电泳：

（6-1）、在电泳槽中加入2.2L的TBE缓冲液，关上盖子，保持电泳槽中的温度为14℃；

（6-2）、将经步骤（5-4）凝固好的胶块放入经步骤（6-1）处理后的电泳槽中，进行电泳；所述电泳时的电压为6V/cm，脉冲时间为10～45秒，电场夹角为120°，电泳时间为22小时；

（7）图像获取：

（7-1）、取出经步骤（6-2）电泳处理的胶块，放在盛放有400ml浓度为0.5μg/ml的EB溶液的托盘内，将托盘放置在摇床上摇20～30分钟；再在托盘中的EB溶液换成400ml纯水，于摇床上脱色30～60分钟；

（7-2）、从托盘中取出胶块，吸除胶块上多余的水份，在凝胶成像系统下拍摄图像。