[发明专利]鱼源链球菌脉冲场凝胶电泳快速分型方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种脉冲场凝胶电泳分型方法，尤其是一种鱼源链球菌脉冲场凝胶电泳快速分型方法。

背景技术

链球菌是在自然界中广泛存在的一种条件致病菌，2009年以来，由无乳链球菌（Streptococcus agalactiae）和海豚链球菌（Streptococcus inia）引起的链球菌病严重制约了我国罗非鱼产业的发展，并呈现发病区域逐年扩大、发病率和死亡率逐年升高，易感罗非鱼规格范围逐年扩大等新趋势。传染性疾病的爆发，需要对致病微生物进行分型，分型方法包括基于表型特征分析的表型方法和基于基因型特征的基因型方法。目前流行的基因型分型方法包括质粒分型、限制性内切酶分析（REA）、脉冲场凝胶电泳（PFGE）分型和基于PCR（聚合酶链反应，polymerase chain reaction）技术的随机扩增多态性DNA标记（RAPD）、扩增片段长度多态性（AFLP）、细菌基因组重复序列PCR技术（rep～PCR）和多位点序列分型（MLST）等。质粒分型的缺点是检测对象是质粒，而不是遗传稳定性更高的染色体；REA技术的缺点是大量小片段DNA用传统琼脂糖电泳难以区分和比较；PCR技术的优点是快速便捷，缺点是检测的都只是染色体的部分片段；而脉冲场凝胶电泳分型方法应用广泛，重复性和稳定性高，检测的是整个染色体DNA，不受表型性状易变的影响，被认为是微生物分子分型的金标准。但目前国际上的链球菌脉冲场凝胶电泳的实验流程一般需要6～8天，耗时较长。脉冲场凝胶电泳的结果取决于DNA分离应用的实验条件以及所研究的微生物的属和种。胶块的制备、细胞的裂解、胶块的水洗温度和时间限制性内切酶选择，电泳参数等许多因素都能影响脉冲场凝胶电泳的结果。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术中存在的不足，提供一种鱼源链球菌脉冲场凝胶电泳快速分型方法，其对链球菌具有更强、更快的分型区分能力。

按照本发明提供的技术方案，一种鱼源链球菌脉冲场凝胶电泳快速分型方法，采用从鱼源上分离并培养得到的链球菌作为分析样品，特征是，包括以下工艺步骤：

（1）胶块制备：

（1-1）、将链球菌样品在血平板培养基上培养18～24小时后，用无菌接种环刮取单菌落重悬于2ml的TE缓冲液中，得到细菌悬浊液，调整细菌悬浊液的OD值为3.6～4.5；

（1-2）、取160～185μL细菌悬浊液于1.5ml离心管中，加入5～10μL浓度为10mg/ml的溶菌酶，混合均匀；将细菌悬浊液与溶菌酶的混合溶液置于37℃水浴中孵育15～30分钟；从水浴中取出离心管，加入5～10μL浓度为20mg/ml的蛋白酶K和5～20μL浓度为1mg/ml的变溶菌素；

（1-3）、将TBE缓冲液和低熔点琼脂糖混合，每100ml TBE缓冲液中加入1～1.5g低熔点琼脂糖，得到凝胶溶液；将凝胶溶液放置在42～45℃的水浴中平衡，备用；

（1-4）、将200μL凝胶溶液加入步骤（1-2）得到的细菌悬浊液中，混合均匀；

（1-5）、将步骤（1-4）得到的混合物加入成胶模具进行凝固，避免气泡产生，在室温下凝固15分钟，得到胶块；

（2）细胞裂解：

（2-1）、配制细胞裂解液：将1.5ml的ES缓冲液加入到50～75μL浓度为20mg/ml的蛋白酶K中，混合均匀，得到细胞裂解液；将细胞裂解液置于冰上，备用；

（2-2）、将1.5ml细胞裂解液加入到2ml的螺旋盖离心管中；

（2-3）、将步骤（1-5）得到的胶块放入步骤（2-2）的螺旋盖离心管中，用刀片削去成胶模具表面多余的胶块，并保证胶块在液面以下，不与离心管的管壁接触；

（2-4）、将步骤（2-3）的螺刻盖离心管放置在54～56℃水浴摇床中孵育90～120min，摇床转速为120～170转/分钟；

（3）洗胶块：

（3-1）、将TE缓冲液和纯水放置在50℃的水浴摇床中预热，备用；

（3-2）、将步骤（2-4）处理后的螺旋盖离心管从水浴摇床中拿出，盖上滤筛盖，倒掉螺旋盖离心管中的细胞裂解液；将胶块转移至5ml的螺旋盖离心管中，向该5ml的螺旋盖离心管中加入4ml经步骤（3-1）预热后的纯水，确保胶块位于液面以下，将螺旋盖离心管放回50℃水浴摇床中摇10～15分钟，水浴处理结束将螺旋盖离心管中的纯水倒掉；再次向螺刻盖离心管中加入4ml步骤（3-1）预热后的纯水，50℃水浴摇床中摇10～15分钟，水浴处理后将螺旋盖离心管中的纯水倒掉；