[发明专利]一种重组人新生血管抑制素及其药物组合物

权利要求书

1.一种重组人新生血管抑制素，其特征在于，氨基酸序列C末端添加6-11个附加氨基酸，所述6-11个附加氨基酸包含序列：HisHisHisHisHisHis。

2.根据权利要求1所述的重组人新生血管抑制素，其特征在于，氨基酸序列是如SEQ ID No.3所示的序列。

3.根据权利要求1或2所述的重组人新生血管抑制素，其特征在于，核苷酸序列是如SEQ ID No.1所示的序列。

4.根据权利要求1所述的重组人新生血管抑制素，其特征在于，氨基酸序列的N末端添加3-6个附加氨基酸，所述3-6个附加氨基酸包含序列：Arg-X-Ser，X代表中性氨基酸或不存在。

5.根据权利要求4所述的重组人新生血管抑制素，其特征在于，氨基酸序列是如SEQ ID No.4所示的序列。

6.根据权利要求5所述的重组人新生血管抑制素，其特征在于，核苷酸序列是如SEQ ID No.2所示的序列。

7.根据权利要求1-2和4-6任一所述的重组人新生血管抑制素，其特征在于，还原条件下SDS-PAGE凝胶电泳的表观分子量为20KDa，并且是以重折叠的形式存在的。

8.一种重组人新生血管抑制素的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

（1）提供SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示的核苷酸编码序列；

（2）将步骤（1）得到的完整长度的核苷酸编码序列与表达载体连接，得到重组人新生血管抑制素的蛋白表达载体；

（3）将步骤（2）得到的重组人新生血管抑制素的蛋白表达载体转化到大肠杆菌表达宿主中，培养被转化的宿主细胞，诱导表达重组人新生血管抑制素蛋白；

（4）收集并破碎细胞，离心得包涵体，将包涵体悬浮于pH9.0、含有20mM Tris、10mM NaCl、4M尿素和体积比例1-10% Triton X-100的洗涤缓冲液中，离心收集包涵体，Ni-NTA柱纯化得到纯化的重组人新生血管抑制素蛋白；

（5）将纯化的重组人新生血管抑制素蛋白以1:5-20的体积比例加入到pH9.0、含有10mM-200mM Tris、0.1mM-5mM DTT、体积比例0.2%-1%Triton X-100和0M-4M尿素的稀释缓冲液缓慢稀释12-24小时，敞口、并不断搅拌，随后利用透析使蛋白充分重折叠，得到表达产物重组人新生血管抑制素。

9.根据权利要求8所述的重组人新生血管抑制素的制备方法，其特征在于所述洗涤缓冲液中Triton X-100的量为4%，所述稀释缓冲液中Tris的量为30mM，DTT的量为1.5mM，Triton X-100的量为0.7%，尿素的量为4M。

10.根据权利要求8所述的重组人新生血管抑制素的制备方法，其特征在于所述表达载体是携带了T7启动子的pET质粒或其衍生物。

11.根据权利要求10所述的重组人新生血管抑制素的制备方法，其特征在于所述表达载体是pET22b。

12.根据权利要求8所述的重组人新生血管抑制素的制备方法，其特征在于所述大肠杆菌表达宿主E.coli M15和JM109细胞系。

13.根据权利要求8所述的重组人新生血管抑制素的制备方法，其特征在于所述表达产物是C末端和N末端的氨基酸附加序列分别是HisHisHisHisHisHis和Arg-X-Ser的重组人新生血管抑制素，X为中性氨基酸或不存在。

14.一种含有权利要求1或4所述重组人新生血管抑制素的药物组合物，其特征在于含1-10mg/ml的重组人新生血管抑制素、质量体积比4%-10%的赋形剂和25mM-100mM NaAc，pH为4.0-5.5。

15.根据权利要求14所述的重组人新生血管抑制素的药物组合物，其特征在于形态为冻干粉剂或水剂。

16.根据权利要求14所述的重组人新生血管抑制素的药物组合物，其特征在于重组人新生血管抑制素浓度为3mg/mL，质量体积比5%的D-甘露醇作为赋形剂和50mM NaAc，pH5.0。