[发明专利]一种重组人新生血管抑制素及其药物组合物

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种重组人新生血管抑制素及其制备和应用。

背景技术

新生血管生成（Angiogenesis）是指从已经成型的血管上形成新的毛细血管的过程。正常的新生血管生成参与许多生理过程，比如胚胎发育、伤口愈合、女性月经周期子宫内膜的重建等。另一方面，不正常的新血管生成是许多病理过程的关键步骤，特别是肿瘤的生长和转移。血管生成是一个包括内皮细胞增殖、迁移和分化、细胞外基质降解、微管形成及芽生新的毛细血管等多个步骤，并有一系列调节因子参与的过程。

肿瘤的发生、生长依赖肿瘤组织周围的血管提供营养，肿瘤的转移需要肿瘤组织周围的血管提供转移途径。切断肿瘤组织的血液供应，就有可能杀死肿瘤细胞，并抑制肿瘤细胞的转移，从而达到治疗目的。另外，肿瘤组织的生长过程中，由于肿瘤细胞之间存在不均一性，因此各个肿瘤细胞的生物学行为也不一样。也就是说，肿瘤细胞具有遗传不稳定性，其基因型极易发生变化，在临床上，肿瘤细胞表现出不同程度的耐药性，这也是制约传统的化疗效果的原因之一。但是，肿瘤新生血管内皮细胞的遗传性状相对稳定，极少发生变异，近年来成为抑制肿瘤生长的新作用靶点，因此肿瘤血管生长抑制剂也成为研究热点。

重组人新生血管抑制素是从实验室培养的血管内皮细胞瘤细胞系中最先分离的，1997年O’Reilly等人发现并鉴定了人新生血管抑制素（endostatin）(参见O’Reilly,et al.Cell,88:277-287,1997)。人新生血管抑制素是人体内十八型胶原蛋白C末端的183个氨基酸残基，分子量约为20KDa。人新生血管抑制素的活性中心位于其蛋白序列的N端，这主要是因为N端区域富含组氨酸，而组氨酸形成的活性结构域能够与Zn²⁺相互作用，从而发挥生物活性。野生型以及正确重折叠的人新生血管抑制素是的氨基酸序列的C端和N端在三维空间结构上相互靠近，位于同一个活性结构域内。进一步研究发现，重组人新生血管抑制素的这种抑瘤作用是通过抑制血管内皮细胞生长，切断肿瘤细胞周围的血液和营养供应而实现的。发现者O’Reilly等人通过大肠杆菌表达系统获得了重组人新生血管抑制素的包涵体，随后发现未重折叠的包涵体蛋白注射到皮下后能够发挥相应的生理活性，并有利于药物作用的缓释。同时他们还发现，这种蛋白在标准条件下复性非常困难，复性过程中99%以上的蛋白都沉淀，完全无法满足大规模生产的需要。到目前为止，重组人新生血管抑制素包含体的复性仍是一个世界性的难题。

为了避免体外重折叠，美国Entrymed公司利用酵母表达系统生产重组人新生血管抑制素。虽然采用酵母生产重组人新生血管抑制素具备成熟的三维构象，可以避免失败率极高体外重折叠，但是酵母表达产率极低，最高产量不超过5mg/L，生产成本非常高，给临床应用带来极大不便。

目前市场上现有的大肠杆菌表达的重组人新生血管抑制素是在野生型人新生血管抑制素的N-端插入5个组氨酸，这虽然在一定程度上提高了的复性率，但是其总体重折叠产率仍较低，进而直接导致药品的生产成本和售价非常昂贵，而且其生物活性没有完全保留。因为N端是人新生血管抑制素蛋白的生物活性区域，主要是因为N端区域富含组氨酸，而组氨酸形成的结构域能够与Zn²⁺相互作用，从而发挥生物活性，所以在N末端插入额外的组氨酸序列会影响N端活性区域的正常结构，影响N端活性结构域与Zn²⁺的作用，进而对蛋白的药物活性产生影响，削弱药物抑制内皮细胞增殖的作用。

因此，有必要进一步提供一种改良的，以更高的产率和更简单的纯化工艺生产重组人新生血管抑制素。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种C末端和/或N末端氨基酸修饰的重组人新生血管抑制素及其制备方法，同时提供一种含有该重组人新生血管抑制素的药物组合物。

本发明的一个目的是提供编码带有C末端附加氨基酸序列的重组人新生血管抑制素。

根据这一目的，本发明采用的技术方案是在人新生血管抑制素的氨基酸序列C末端添加6-11个附加氨基酸，所述6-11个附加氨基酸包含以下序列：HisHisHisHisHisHis。

根据本发明这一目的的一个优选方案是在人新生血管抑制素的氨基酸序列C末端添加6个附加氨基酸，这6个氨基酸的序列为HisHisHisHisHisHis，全长氨基酸序列是如SEQ ID No.3所示的序列。

为得到SEQ ID No.3所示的氨基酸序列，可以采用的一种优选的核苷酸序列是如SEQ ID No.1所示的序列。