[发明专利]一种蛋白质样品原位快速预处理方法

权利要求书

1.一种蛋白质样品原位快速预处理方法，其特征在于：整个蛋白质样品预处理过程，包括蛋白质样品的变性、还原、溶剂置换、烷基化、酶解及杂质去除过程，皆在离心超滤装置中原位进行，具体包括：

（1）采用pH为1-6.5的酸性溶液或pH为7.5-14的溶有体积浓度为1%-30%的表面活性剂或去垢剂的碱性溶液溶解蛋白质样品，将样品溶液加入至离心超滤装置的超滤管中实现蛋白质的原位富集；

（2）蛋白质样品溶液经步骤（1）处理后，若蛋白质样品后续还原过程所需溶液体系环境与蛋白质样品溶解液体系环境所需酸碱环境不同，则需进行pH置换，即将离心超滤装置离心后向超滤管中加入pH为蛋白质样品还原过程所需pH范围的溶液；若后续蛋白质样品还原过程所需溶液体系环境与蛋白质样品溶解液体系环境所需酸碱环境相同，则不需要进行pH置换。

（3）向步骤（2）中处理的样品溶液中加入还原剂，同时进行蛋白质样品的变性及还原过程；

（4）将步骤（3）中处理的样品溶液经离心后，向超滤管中加入pH为7.5-14的碱性缓冲溶液或水溶液并离心，实现杂质的去除；

（5）向步骤（4）中离心后的超滤管中加入以pH为7.5-9的碱性缓冲溶液为溶剂配制的烷基化溶液及胰蛋白酶溶液后，将样品转入至盛有水的微波盒，并将微波盒转入至微波炉中，采用微波水浴辅助方法同时进行烷基化及酶解过程；

（6）酶解完成后，将离心超滤装置进行离心，保留离心超滤装置的收集管内所得溶液；向超滤管中加入蒸馏水，将离心超滤装置进行离心，保留收集管内所得溶液，将两次收集管中所得溶液混合，即为所需的蛋白质酶解产物。

2.按照权利要求1所述蛋白质样品原位快速预处理方法，其特征在于：所述的蛋白质样品溶剂，pH为1-6.5的酸性溶液，可为甲酸、三氟乙酸、三氯乙酸或醋酸溶液；pH为7.5-14的碱性缓冲溶液，可为碳酸氢铵缓冲盐溶液、磷酸缓冲盐溶液或三羟甲基氨基甲烷缓冲盐溶液；

所述的表面活性剂为十二烷基磺酸钠、脱氧胆酸钠、Triton X-100、chaps、Rapigest SF或NP-40d；去垢剂为尿素、硫脲或盐酸胍。

3.按照权利要求1所述蛋白质样品原位快速预处理方法，其特征在于：所述的离心超滤装置为商品化的由超滤管及收集管组成的纯化装置；超滤管为底部置有热密封超滤膜的圆柱体结构。

4.按照权利要求1所述蛋白质样品原位快速预处理方法，其特征在于：步骤（1）中所述的蛋白质样品溶液在超滤管中体积范围为50μL-1mL，对应蛋白质样品的质量范围为10ng-1mg。

5.按照权利要求1所述蛋白质样品原位快速预处理方法，其特征在于：步骤（2）中所述的溶剂pH置换方法具体如下，若蛋白质溶解液体系为权利要求2中所述的pH为1-6.5的酸性溶液，而后续还原过程所需溶液体系为碱性环境，则在蛋白质原位富集后将离心超滤装置离心，待超滤管内溶剂全部离心至收集管后，向超滤管中加入体积为1-20倍蛋白质溶解液体积的权利要求2中所述的pH为7.5-14的碱性缓冲溶液；若蛋白质溶解液体系为权利要求2中所述的pH为7.5-14的碱性缓冲溶液，而后续还原过程所需溶液体系为酸性环境，则在蛋白质原位富集后将离心超滤装置离心，待超滤管内溶剂全部离心至收集管后，向超滤管中加入体积为1-20倍蛋白质溶解液体积的权利要求2中所述的pH为1-6.5的酸性溶液。

6.按照权利要求1所述蛋白质样品原位快速预处理方法，其特征在于：步骤（3）中所述的还原剂为二硫苏糖醇（DTT）、磷酸三氯乙酯（TCEP）或β-巯基乙醇；终浓度为1-200mM；

所述的蛋白质变性及还原条件为80-100℃水浴下进行，时间为1-20min。

7.按照权利要求1所述蛋白质样品原位快速预处理方法，其特征在于：步骤（5）中所述的向超滤管中加入的烷基化溶液及胰蛋白酶溶液的溶剂为权利要求2中所述的pH为7.5-14的碱性缓冲溶液，但其pH范围需调节至7.5-9；

所述的烷基化试剂为碘代乙酸或碘乙酰胺，终浓度为1-200mM；

所述的样品酶解过程中使用胰蛋白酶与蛋白质的质量比例为1:10–10:1。