[发明专利]一种蛋白质样品原位快速预处理方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种蛋白质样品原位快速预处理方法。

背景技术

蛋白质的鉴定与社会人群的健康息息相关。对于大部分遗传疾病，如肿瘤和肥胖症，患者与健康人群的某些特定蛋白存在差异性表达。为实现疾病的“早发现，早治疗”，对特定蛋白质的快速及高灵敏度的鉴定具有重要意义。作为蛋白质分析的首要步骤，蛋白质样品预处理可实现杂质的去除及样品的富集，因此建立高效快捷的蛋白质样品预处理方法，在实现高灵敏度、高准确度的差异性蛋白质的研究过程中发挥重要作用，进而推动疾病的发现与治疗上的深入研究。

目前，基于凝胶的样品预处理和基于自由溶液的样品预处理是蛋白质组常用的两大技术。然而，胶上酶解耗时长，后续处理复杂，且样品损失严重。此外，酶解效率与肽段的提取效率有待提高；自由溶液酶解具有酶解时间长（通常需要10h以上）的缺点，无法满足快速处理的要求。近些年来发展的酶反应器具有酶解时间短，酶解效率高，可与多维分离平台联用，实现自动化等优点。然而，酶反应器基质材料的非特异性吸附问题会造成酶解重现性差，不利于样品的分析。（Liang,Y;Tao,D.Y.;Ma,J.F.;Sun,L.L.;Liang,Z.;Zhang,L.H.;Zhang,Y.K.J.Chromatogr.A2011,1218(20),2898-2905）

近年来大量有关超滤膜的实验结果表明，超滤膜的使用具有很好的去噪效果、样品损失量较小、易实现溶剂置换的优势。同时，微波辅助由于其高效性早已被用于样品预处理过程中。本发明结合了超滤膜的去噪性能和微波水浴辅助酶解的高效性，并提出了样品在膜上原位进行样品预处理所有步骤，进一步减少样品的损失量，从而发展出一种新型样品预处理方法，具有高效、快速、回收率高的优点。

发明内容

为了克服蛋白质样品预处理过程耗时长，操作繁琐，损失量大等不足，本发明提供一种蛋白质样品原位快速预处理方法，于离心超滤装置中集成了蛋白质的变性、还原、溶剂置换、烷基化、酶解及杂质去除整个样品预处理过程。同时，采用微波水浴辅助酶解，可有效降低酶解时间，提高酶解效率。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

（1）蛋白质样品的原位富集：采用pH为1-6.5的酸性溶液或pH为7.5-14的溶有体积浓度为1%-30%的表面活性剂（十二烷基磺酸钠、脱氧胆酸钠、TritonX-100、chaps、Rapigest SF或NP-40d）或去垢剂（尿素、硫脲或盐酸胍）的碱性溶液溶解蛋白质样品，将蛋白质样品溶液加入至超滤管中实现蛋白质的原位富集；

（2）溶剂的置换：蛋白质样品溶液经步骤（1）处理后，若蛋白质样品后续还原过程所需溶液体系环境与蛋白质样品溶解液体系环境所需酸碱环境不同，则需进行pH置换，即若蛋白质溶解液体系为pH为1-6.5的酸性溶液（甲酸、三氟乙酸、三氯乙酸或醋酸溶液），而后续还原过程所需溶液体系为碱性环境，则在蛋白质原位富集后将离心超滤装置离心，待超滤管内溶剂全部离心至收集管后，向超滤管中加入体积为1-20倍蛋白质溶解液体积的pH为7.5-14的碱性缓冲溶液（碳酸氢铵缓冲盐溶液、磷酸缓冲盐溶液、或三羟甲基氨基甲烷缓冲盐溶液）；若蛋白质溶解液体系为pH为7.5-14的碱性缓冲溶液，而后续还原过程所需溶液体系为酸性环境，则在蛋白质原位富集后将离心超滤装置离心，待超滤管内溶剂全部离心至收集管后，向超滤管中加入体积为1-20倍蛋白质溶解液体积的pH为1-6.5的酸性溶液；若后续蛋白质样品还原过程所需溶液体系环境与蛋白质样品溶解液体系环境所需酸碱环境相同，则不需要进行pH置换；

（3）蛋白质样品的变性及还原：向步骤（2）中处理的样品溶液中加入还原剂（二硫苏糖醇（DTT）、磷酸三氯乙酯（TCEP）或β-巯基乙醇），在高温水浴下，同时进行蛋白质样品的变性及还原过程；

（4）杂质的去除：将步骤（3）中处理的样品溶液经离心后，向超滤管中加入体积为蛋白质样品还原体系溶液体积的1-20倍的pH为7.5-14的碱性缓冲溶液（碳酸氢铵缓冲盐溶液、磷酸缓冲盐溶液、或三羟甲基氨基甲烷缓冲盐溶液）或水溶液并离心，去除蛋白质溶液中的小分子杂质；

（5）蛋白质样品的烷基化及酶解：向步骤（4）中离心后的超滤管中加入以pH为7.5-9的碱性缓冲溶液为溶剂配制的烷基化溶液（碘代乙酸或碘乙酰胺）及胰蛋白酶溶液后，将样品转入至盛有水的微波盒，并将微波盒转入至微波炉中，采用微波水浴辅助方法同时进行烷基化及酶解过程；