[发明专利]一种HPV-E6蛋白的检测方法

说明书

技术领域

本发明属于生物化学领域，具体涉及一种HPV-E6蛋白的检测方法。

背景技术

HPV病毒（人乳头瘤病毒缩写）是一种属于乳多空病毒科的乳头瘤空泡病毒A属，是球形DNA病毒，能引起人体皮肤黏膜的鳞状上皮增殖。目前已分离出130多种，该病毒只侵犯人类，对其它动物无致病性，人体一旦感染会终生携带。不同的型别引起不同的临床表现，约35种型别与生殖道感染有关，大约20种型别与癌症相关，与宫颈癌相关的高危HPV有13种：16，18，31，33，35，39，45，51，52，56，58，59，68；其中16和18比较常见。HPV-E6蛋白就是16和18型特异性表达的蛋白，被用来检测人体是否感染HPV高致癌型的早期诊断指标。

已知测定HPV-E6蛋白的方法有免疫扩散法、免疫电泳法、放射免疫分析法。这些方法都存在操作繁琐，需要特殊的设备，样品需要预处理，不能进行批量样本分析和不能直接上全自动化生化分析仪检测等缺点。

发明内容

发明目的：本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种HPV-E6蛋白的检测方法。

技术方案：为了达到上述发明目的，本发明具体是这样来完成的：一种HPV-E6蛋白的检测方法，包括以下步骤：

（1）配制HPV-E6蛋白反应剂：取5-200mmol/L缓冲液，以其作为基数，加入其重量0.1%-5%防腐剂、0.1%-1%稳定剂、0.1%-40%电解质氯化钠和20%-40%高分子加速剂混合；

（2）配制抗HPV-E6蛋白抗体试剂：取抗HPV-E6蛋白抗体，以其为基数，加入其重量0.001%-5%的抗氧化剂和20%-40%的稳定剂混合；

（3）将HPV-E6蛋白反应剂与抗HPV-E6蛋白抗体试剂按体积比3～100:1混合；

（4）配制一提血清型恒定值校准液：取浓度为20～100mmol/L的缓冲液50～100ml，加入其体积1～5%的防腐剂，5～20%的稳定剂，防腐剂浓度为0.01～10mmol/L，稳定剂浓度为0.1～40mmol/L；

（5）在340nm波长下测定步骤（3）所得混合液的吸光值，与步骤（4）的恒定标准液比较，计算出样本中HPV-E6蛋白含量。

其中，上述步骤（1）中另加入缓冲液重量基数0.1%-10%表面活性剂和2%～8%反应促进剂；其中表面活性剂为非离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、阴离子表面活性剂或两性离子表面活性剂，反应促进剂为溴化己二甲胺，浓度为0.01-19mmol/L。

其中，所述步骤（1）中的缓冲液为磷酸盐缓冲液、三羟甲基氨基甲烷缓冲液，PIPES缓冲液、HEPES缓冲液、TAPS缓冲液、甘氨酸缓冲液或硼酸缓冲液，优选pH值为5～10的磷酸盐缓冲液，更优选的为pH值为7.4～8.1的磷酸盐缓冲液。

其中，所述步骤（1）和（4）中的防腐剂为叠氮钠、对羟基苯甲酸、苯酚或广谱杀菌剂。

其中，所述步骤（1）和（2）中的稳定剂为氯化镁、乙二醇或海藻糖。

其中，所述步骤（1）中的高分子加速剂为聚乙二醇2000、聚乙二醇4000、聚乙二醇6000或聚乙二醇8000。

其中，所述步骤（2）中的抗氧化剂为丁基羟基茴香醚、硫代二丙酸二月桂酯、二丁羟基甲醛或苯多酚。

其中，所述步骤（2）中的抗HPV-E6蛋白抗体为羊抗人HPV-E6蛋白抗血清、马抗人HPV-E6蛋白抗血清、鼠抗人HPV-E6蛋白抗血清或兔抗人HPV-E6蛋白抗血清。

其中，所述步骤（4）中的缓冲液为PBS、Tris、TAPS、HEPPS、CHES、CAPS、CAPSO、POPSO、Trice、甘氨酸、双甘氨酸、二甘氨酸或硼酸盐。

其中，所述步骤（4）中的稳定剂的实例可以是乙二胺四乙酸二钠、氯化镁、丙三醇、单糖、多糖中的一种或多种混合。

本发明利用抗原抗体反应，加入反应剂，解除样品抗原周围的电子层和水化层，使抗原位点充分暴露，然后加入抗HPV-E6蛋白抗体试剂；高特异性的抗HPV-E6蛋白与样品中相应的HPV-E6蛋白抗原反应，形成不溶性的抗原抗体复合物，产生一定的浊度，其浊度的高低与样本中HPV-E6蛋白含量成正比，在规定波长下测定该不溶物抗原-抗体复合物的吸光值，与已知恒定的标准液比较，则可计算出样本中HPV-E6蛋白含量。

有益效果：本发明中样本无需稀释、操作简单、准确度高、重复性好、抗干扰能力强、适用于各种类型的全自动生化分析仪的特点。

具体实施方式

实施例1：