[发明专利]脱硫酸化肝素衍生物亲和色谱材料的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及系列的脱-2-O硫酸化肝素衍生物、脱-6-O硫酸化肝素衍生物、脱-N位硫酸化再乙酰化肝素衍生物亲和色谱材料的制备，属于生物亲和色谱材料领域。

背景技术

肝素是被高度硫酸化的糖胺聚糖，它是由己糖醛酸和葡糖胺以1-4糖苷键链接起来的重复的二糖单位构成。构成肝素的主要二糖单位是含有三个硫酸基的糖醛酸-葡萄糖胺二糖。这种三硫酸二糖的重复排列形成了肝素的所谓“高度硫酸化区域”，是肝素结构的主要部分。研究表明，肝素具有抗平滑肌增生，抗凝血活性，抗肿瘤及抗病毒等生物学功能，它通过二糖序列中不同硫酸化位点与多种蛋白质相互作用，调控这些生物功能。已知，C-6-氧和C-2-氧硫酸基团是抗平滑肌增生活性所必需的；脱2-O-硫酸和脱3-O-硫酸肝素具有抑制肿瘤细胞由来的类肝素酶的活性；C-6-氧和C-3-氧硫酸基团是抗凝血活性所必需的。因此，硫酸化位点是决定肝素生物功能的重要因素。

由于肝素的特殊结构和重要生物功能，肝素亲和色谱材料得到了广泛的研究和应用。多种不同活化载体的肝素亲和色谱材料已商品化，这些亲和材料可作为阴离子交换树脂分离与富集多种蛋白质。由于硫酸化位点是肝素的重要结构，它调控多种重要的生物功能，因此肝素脱硫酸化衍生物是研究肝素结构与功能关系的重要材料。以脱硫酸化肝素衍生物为配基的亲和色谱材料可用于研究硫酸化位点与蛋白质的相互作用，以及功能性蛋白质的分离与富集。国内外未见报道脱-2-O、脱-6-O、脱-N位硫酸化再乙酰化肝素衍生物亲和色谱材料的制备。

发明内容

本发明合成了三种以肝素衍生物为配体，琼脂糖凝胶颗粒为载体，非特异性吸附小，质量稳定的肝素衍生物亲和色谱层析材料，该材料适合于蛋白质的分离富集，以及对肝素的结构与功能的研究。

本发明的载体为具有非特异性吸附小的琼脂糖凝胶颗粒，配体是通过化学修饰制备得到的肝素衍生物，其中包括脱-2-O-硫酸化肝素衍生物（[C₁₂O₁₆NS₂H₆]n）、脱-6-O-硫酸化肝素衍生物（[C₁₂O₁₆NS₂H₆]n）、脱-N位硫酸化再乙酰化肝素衍生物（[C₁₄O₁₈NS₂H₈]n）。这些衍生物的脱硫酸化程度均达到95%以上。上述n=1，2 ，3 ，4 ，……   。        

本发明的主要要点是通过环氧氯丙烷活化和氨化反应制备含有末端氨基的凝胶颗粒，而后利用还原氨化反应通过肝素衍生物末端醛基将其胶连在载体上，最后通过乙酰化反应将未参与还原氨化反应的氨基屏蔽，制备得到一系列新型亲和色谱材料。

本发明实现上述目的的技术方案如下：

本发明首先提供了系列硫酸化肝素衍生物亲和色谱材料的制备方法，具体如下：

本发明的一种脱-2-O硫酸化肝素衍生物亲和色谱材料的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

（1）琼脂糖凝胶颗粒的活化：取洗净抽干后的凝胶颗粒，按每1g凝胶溶于1-3ml的0.6M NaOH中，并且加入0.1-0.2ml 环氧氯丙烷，在40℃水浴摇床中反应2小时，再充分水洗，抽干，加入2倍体积的浓氨水，于40℃水浴、120rpm/min摇床中摇动2小时，充分水洗抽干备用，得活化的琼脂糖凝胶颗粒A；

（2）活化的琼脂糖凝胶颗粒和脱-2-O硫酸化肝素衍生物的交联：取以上活化后的琼脂糖凝胶颗粒A，并按每克凝胶溶于1ml pH为6.8-8，0.2M的磷酸缓冲溶液中，加入30-50mg的脱-2-O硫酸化肝素衍生物，再加入2-6mg氰基硼氢化钠，在室温条件下剧烈摇动反应2-5天，过滤，滤液冻干回收，得肝素衍生物凝胶颗粒B；

(3) 琼脂糖凝胶颗粒的乙酰化：取以上肝素衍生物凝胶颗粒B，按每克凝胶溶于2 ml 0.2M乙酸钠溶液中，并加入1ml的乙酸酐，在0℃条件下搅动反应60min，而后在室温条件下，再加入1ml乙酸酐搅动反应60min；先用100ml纯净水水洗，再用100ml 0.5M NaCl洗，再充分水洗抽干得到肝素衍生物亲和色谱材料。

本发明的一种脱-6-O硫酸化肝素衍生物亲和色谱材料的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：