[发明专利]新型多肽、水解抗菌肽及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体说涉及一种新型多肽及其重组水解抗菌肽的制备方法。

背景技术

抗生素的滥用会导致药物残留等公共卫生问题，并引发耐药菌株和新的致病亚型菌株的出现，使得细菌性疾病的防治再次成为困扰人类的难题。开发新的抗菌药物成为一个越来越重大的研究课题。

抗菌肽是一种小分子的多肽类物质，具有广谱抗菌活性，对原核生物有作用，对真核生物无害。抗菌肽是生物防御系统中产生的一类对抗外源性病原体的肽类物质，是生物先天的、非特异性防御系统的重要组成部分。抗菌肽可与革兰阴性菌外膜的脂多糖或革兰阳性菌表面的肽聚糖结合，使其被破坏而形成穿膜通道，胞内离子大量流出，细胞因高渗破裂而死亡，不易产生耐药性。另外，它还具有免疫调节、促进损伤修复、中和内毒素及对抗脓毒性休克的作用。因此，抗菌肽具有极广泛的应用价值。

然而，抗菌肽的生产技术一直是个瓶颈。天然抗菌肽由于含量低，提取成本高，不可能实现产业化。可能实现抗菌肽大规模生产的技术平台有化学合成和基因工程技术。因制备成本相对较低，运用基因工程方法生产重组抗菌肽是一个令人关注的途径。大肠杆菌是迄今为止体内表达多肽最常用的宿主微生物，然而抗菌肽对大肠杆菌有毒性，经常不能成功表达，或以无活性的包含体形式表达，以最大程度减轻对宿主细胞的毒性。这对需正确折叠才有抗菌活性的大多数天然抗菌肽来说是致命的。一般地，线性抗菌肽的抗菌活性不依赖于结构。若线性抗菌肽串联起来在大肠杆菌中以包含体形式高效表达，再将包含体水解，将会直接释放出有活性的抗菌肽，这是利用大肠杆菌规模化生产高活性抗菌肽的有效途径。

发明内容

有鉴于此，本发明提供一种核苷酸序列、含有该序列的重组载体及重组菌株，它们可以用于抗菌肽的制备。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

编码抗菌肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO：1所示。

含有所述的核苷酸序列的重组载体。

所述的重组载体，在所述核苷酸序列的5’端引入BamHI位点，且在3’端XhoI引入位点，酶切后得酶切片段，同时对pGEX-4T-1上述位点进行酶切后，连接所述酶切片段和酶切后的pGEX-4T-1连接，得重组载体。

所述重组载体制备的重组菌株。

本发明的目的之二在于提供新型多肽及其制备方法，所述新型多肽为具有抗菌效果的多肽的中间品。其制备方法简单，可用于工业化生产。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

所述的核苷酸序列编码的抗菌肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

选择具有高抗菌活性的线性抗菌肽元件，线性抗菌肽元件有：1)RRWRIVVIRVRR、2)RIWVIWRR、3)RLARIVVIRVAR(Patel DA，et al.2012)、4)RLCRIVVIRVCR、5)ILPWKWPWWPWRR(Hilpert K，et al.，2008)。把这些抗菌肽元件串联，按大肠杆菌偏好的密码子优化设计编码序列。

所述的抗菌肽的制备方法，具体包括以下步骤：

A抗菌肽基因的合成及表达载体构建

将如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的编码序列5’和3’端引入BamHI和XhoI酶切位点，与pGEX-4T-1分别进行酶切后再连接构建重组质粒，并转化到BL21，构建重组菌株；

B诱导表达

步骤A所得重组菌株单菌落接种于含100μg/mL氨苄青霉素的BL培养基，37℃培养过夜，按5％体积比接种于100mL BL培养基中，37℃振摇培养至细菌浓度达到OD₆₀₀＝0.6时，按0.1mmol/L加入IPTG，37℃、180r/m振摇培养5h，4℃、12000r/m离心10min收集菌体，按每100ml培养液加入20ml PBS重悬沉淀，得抗菌肽。

所述的抗菌肽的制备方法，步骤A所得重组菌株抗性培养至富集后，收集菌体，所述菌体中含有所述抗菌肽。

本发明的目的之三在于提供具有抗菌活性的多肽制剂，其抗菌效果好，商业应用价值大。

所述的抗菌肽制剂，所述制剂为水解抗菌肽。

所述的制剂的制备方法，在所述抗菌肽中调节pH值至2.0，加入胃蛋白酶，37℃孵育5h，用NaOH溶液调节pH至7.0，12000r/m离心10min，收集上清。上清经微滤、喷雾干燥或冻干，即为水解多肽制剂。