[发明专利]一种密度感应淬灭菌的检测方法

说明书

技术领域

本发明属于水产微生物检测技术领域，具体涉及一种密度感应淬灭菌的检测方法。

背景技术

随着国内海水养殖业的迅速发展，养殖规模不断扩大，集约化程度也不断提高。但是伴随而来的如养殖水体的污染，有害病菌的大量繁殖等一系列问题也不断出现，致使我国海水养殖业蒙受巨大的损失。目前对于病害的控制一方面通过提高养殖水体质量、降低养殖密度等手段保障健康的养殖环境，另一方面通过注射疫苗、使用免疫增强剂等手段提高养殖动物自身的抗病害能力。但是当病害大规模发生时，使用广谱抗生素还是最普遍的手段。然而，抗生素不仅仅可以抑制或杀灭病原微生物，还能抑制有益微生物，从而导致养殖动物体内外微生态平衡的破坏。由此带来的药物残留、细菌耐药性等问题，已经成为阻碍我国海水养殖业可持续发展的瓶颈。因此，寻找经济、环境友好的水产病害防治方法已经成为海水养殖业健康可持续发展的迫切要求。相应的，密度感应抑制技术作为抗生素的替代手段来进行海水养殖病害防治，因具有不易产生细菌抗药性、不会破坏养殖动物体内外的微生态平衡等优点，已经越来越受到人们的重视。

密度感应(quorum sensing，QS)是一种微生物之间群体密度依赖性的基因调控机制。细菌在生长的过程中，会合成一类小分子物质称为（autoinducers，AIs），通过自由扩散或主动运输释放到周围环境中。自诱导物的浓度随着环境中细菌群体数量的增加而增加，当其达到阈值浓度后，与受体蛋白结合，触发信号的传递，激活或抑制相关靶基因的转录表达，从而同步调控细菌整个群体的行为，以此来适应环境的变化。目前已经报道的信号分子主要有革兰氏阴性菌的N-酰基高丝氨酸内酯分子（N-acyl homoserine lactone，AHL）、革兰氏阳性菌的寡肽分子（autoinducing peptide，AIP）以及在革兰氏阴性和阳性菌中普遍存在的AI-2分子。

近几年的研究证明，AHL类的QS系统和致病菌的致病性密切相关，如铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）利用QS系统来调控其生物膜的形成和抗药性的产生；胡萝卜欧文氏菌（Erwinia carotovora）是一种植物病原菌，利用AHL类的QS系统来调控植物细胞壁降解酶的表达；鳗弧菌（Vibrio anguillarum）拥有2套AHL类的QS系统（LuxM/N系统和VanI/R系统），以此来调控金属蛋白酶、色素等基因的转录和表达。

而密度感应淬灭（quorum quenching，QQ）是指通过干扰信号分子的产生、释放、信号的转导以及降解信号分子等方式达到阻抑QS通路的作用。密度感应抑制技术即通过密度感应淬灭作用，干扰密度感应系统，在不杀死细菌的情况下特异性阻断致病菌毒力基因的表达，在有效预防和控制病害的同时而不破坏海水养殖动物微生物生态环境。另外QQ作用对细菌并不会产生“生”或“死”的选择压力，理论上来说几乎不会产生细菌抗药性等问题。因此深入探索密度感应抑制技术，发展环境友好型病害防治手段对我国海水养殖业的可持续发展具有重要意义。

目前发现的AHL类的QS系统的密度感应淬灭活性物质主要有信号分子降解酶和QS阻抑小分子物质。小分子阻抑物主要有呋喃酮、肉桂醛及其衍生物和信号分子类似物。动物模型侵染实验表明呋喃酮和肉桂醛等小分子阻抑物能够大大降低哈维氏弧菌和铜绿假单胞菌等致病菌的致病性。目前在很多种细菌中发现了信号分子降解酶，根据降解机制的不同可分为三类：AHL内酯酶（内酯环水解作用），AHL酰基转移酶（氨基水解作用）以及AHL氧化还原酶（氧化还原作用）。AHL降解酶尤其是AHL内酯酶对不同长度酰基链的信号分子（C4-C12）均具有高效的降解活性。动物实验表明，在毕赤酵母表达系统中过量表达的AHL内酯酶(AiiA)和嗜水气单胞菌混合注射鲤鱼能大大降低鲤鱼的致死率。AHL降解菌株的富集培养液能提高卤虫和大菱鲆的成活率以及增强罗氏沼虾对哈维氏弧菌的抵抗力。因此在防治海水养殖病害方面，密度感应淬灭菌株具有很广阔的发展前景。但目前还没有有效的对环境中是否存在密度感应淬灭菌进行检测的方法。