[发明专利]一种筛选与PRRSV感染和抗性相关的基因的方法

权利要求书

1.一种筛选与PRRSV感染和抗性相关的基因的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

（1）样品挑选：选取两个品种的对蓝耳病有抗性差异的35日龄猪，分别取两个品种猪在未感染PRRSV前的组织样和感染PRRSV后第5天的组织样，各组织样均存放在RNA保存液RNAlater中；

（2）提取样品总RNA：提取RNA保存液RNAlater中的各组织样的总RNA；

（3）Solexa文库构建：从总RNA中纯化mRNA，合成双链cDNA片段并进行纯化；

（4）测序：将各组织样的cDNA片段用cluster station放入芯片中进行扩增，然后用genome analyzer II进行pair-end测序；

（5）利用FASTX检测过滤低质量Reads；

（6）利用BWA0.5.8将Reads比对猪基因组，对单一比对上的序列进行注释，并计算每个基因的表达量，基因表达量用RPKM值表示，计算公式为：

RPKM=比对上的reads数/总reads数/基因长度×10⁹；

（7）利用DEGseq软件分析差异表达基因，符合P≤0.001，FDR≤0.001，|log2foldchange|≥1则为差异显著；

（8）与PRRSV感染和抗性相关基因的获取：根据上一步标准所筛得的差异表达基因，获得两个品种感染前和感染后第5天的差异显著基因交集a和感染前两个品种间的差异表达基因集b，a与b的交集的基因即为与PRRSV感染和抗性相关的候选基因。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）中选取两个品种的对蓝耳病有抗性差异的35日龄长白猪和通城猪各6头，隔离饲养，分别取两个品种猪在未感染PRRSV前的肺组织样，每个品种猪取3头，然后将剩余的两个品种猪接种蓝耳病毒，在感染PRRSV后第5天取肺组织样，每个品种猪取3头，各肺组织样均存放在RNA保存液RNAlater中。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中用trizol RNA提取试剂提取各组织样的总RNA，并用Nanodrop2000检测，选取OD_260/280=1.8～2.2，OD_260/230≥2.0，28S:18S≥1.0，23S:16S≥1.0，密度≥400ng/ul的总RNA，将相同品种的3个个体的总RNA混合。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3）Solexa文库构建的方法包括如下步骤：

（A1）从10ug总RNA中用连接有poly-T的磁性小珠纯化mRNA；

（A2）预热PCR仪到94°C，将纯化的mRNA与反应混合液共20ul放入PCR管中，在PCR仪上94°C加热5分钟，切断mRNA；

（A3）用反转录酶和随机引物将切断的mRNA反转成第一链cDNA，去除第一链cDNA中的RNA，合成双链cDNA分子；

（A4）用T4DNA聚合酶和klenow聚合酶修复cDNA分子的粘膜端，形成平末端cDNA分子，在补平的cDNA分子3’平末端加一个腺苷酸A，并连接上具有T末端的接头；

（A5）电泳并回收纯化上述反应产物，PCR反应扩增纯化的cDNA片段。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（5）中，过滤掉质量小于20、碱基的总数目小于整个reads总数目的50%的reads。