[发明专利]一种筛选与PRRSV感染和抗性相关的基因的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种利用高通量测序结合生物信息学的方法筛选与蓝耳病毒（PRRSV）感染和抗性相关的基因的方法。

背景技术

目前猪呼吸与繁殖系统综合征（PRRS)最早出现在20世纪八十年代中期的美国，随后欧洲也被发现，最初病因不明确，被称作神秘猪病，因为该病会引起病猪四肢末端充血，耳朵发蓝，又叫蓝耳病。该病临床症状表现为母猪流产，木乃伊胎，死胎，育成猪生长发育缓慢，间质性肺炎等。1991年荷兰首先从病猪身上分离出了一种RNA病毒Lelystad Virus（I型蓝耳病毒），同时美国分离出了另一种病毒VR-2332(II型蓝耳病毒)，从而明确了该病的致病原因是由一种病毒引起的。中国大陆在1996年首次发现蓝耳病，到2006年在全中国又爆发了一场大规模的高热病，感染了200万以上头造成大约40万死亡，而且不同于传统的蓝耳病毒，该病毒还感染了大量的成年母猪，后证实该病是由一种高致病性的蓝耳病毒引起的，是一种变异的II型蓝耳病毒，与一种中国的蓝耳病病毒亚型HB-1高度同源，该病毒有一个特点是在非结构蛋白2（NSP2）区有一个不连续的20个氨基酸的缺失。

病毒的靶细胞主要是肺泡巨噬细胞或者单核细胞来源的树突状细胞。感染PRRSV后，不能引起有效的免疫应答，感染初期产生的抗体不具备中和抗体的效果，而且病毒可能会借助抗体进入细胞，形成抗体依赖的增强效应，从而促进病毒的扩散。体内和体外细胞实验证实病毒感染后引起非典型的天然免疫应答效应：I型干扰素IFN-alfa，TFN-alfa的表达受到抑制，白细胞介素-10（IL-10）表达量升高，从而引起病毒免疫抑制和持续感染。感染PRRSV后在2-3周以后才能引起细胞免疫反应，而且检测到的免疫细胞同其他病毒如伪狂犬病毒相比较少，同时产生的CD3CD8high细胞不具有杀伤细胞活性，从而可能不能及时清除体内的病毒。蓝耳病毒的突变率很高，类型多，目前的疫苗的效果有限而且弱毒苗具有反强的危险性，在防治上比较困难，急需寻找一种新的方法来弥补传统方法的不足。有报道用RNAi的方法，设计针对PRRSV的shRNA可以在体内和体外抑制PRRSV的增殖，也有研究用干扰素可以抑制PRRSV在体外细胞MRAC-145上的复制。不同的个体和品种对PRRSV的抗性也有差异。

高通量第二代测序方法（如：Illumina’s Genome Analyzer II)，具有识别单个碱基变异的高分辨率，运用pair-end方法可以提高测序的效率和reads的长度，通过把测序的Reads比对到参考基因组上，高通量测序方法可以更准确地提高基因组的注释信息，识别非转录区，新转录本和可变剪接，也可以分析基因表达差异信息。

如果能够得知与蓝耳病毒感染相关或抗性有关的基因，就能得到治疗和防治蓝耳病的新的靶点，继而进一步得到多种防治蓝耳病的方法，但是至今鲜有运用高通量测序方法来分析筛选与蓝耳病毒感染和抗性有关的基因的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种筛选与蓝耳病毒（PRRSV）感染和抗性相关的基因的方法，从而为治疗和防治蓝耳病寻找新的靶点。

具体的，本发明的目的是提供一种利用高通量测序结合生物信息学的方法筛选与PRRSV感染和抗性相关的基因的方法，利用所述方法分析感染前后和不同品种间的差异基因，继而筛选得到一些与PRRSV感染和抗性相关的基因。

本发明的筛选与PRRSV感染和抗性相关的基因的方法，包括如下步骤：

（1）样品挑选：选取两个品种的对蓝耳病有抗性差异的35日龄猪，分别取两个品种猪在未感染PRRSV前（第0天）的组织样和感染PRRSV后第5天的组织样，各组织样均存放在RNA保存液RNAlater中；

（2）提取样品总RNA：提取RNA保存液RNAlater中的各组织样的总RNA；

（3）Solexa文库构建：从总RNA中纯化mRNA，合成双链cDNA片段并进行纯化；

（4）测序：将各组织样的cDNA片段用cluster station放入芯片（Flow cell）中进行扩增，然后用genome analyzer II进行pair-end测序；

（5）利用FASTX检测过滤低质量Reads；

（6）利用BWA0.5.8将Reads比对猪基因组，对单一比对上的序列进行注释，并计算每个基因的表达量，基因表达量用RPKM值表示，计算公式为：

RPKM=比对上的reads数/总reads数/基因长度×10⁹