[发明专利]一种利用单双链复合体解析真菌菌群结构的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种真菌菌群结构的解析方法，更具体涉及一种利用单双链复合体解析真菌菌群结构的方法。

背景技术

DGGE（变性梯度凝胶电泳）和TGGE（温度梯度凝胶电泳）是两种基于DNA片段序列差异的电泳技术，目前已经成为微生物菌群多样性研究的重要手段。这两种技术可以分离长度相同但序列不同的DNA片段，DNA片段的分离是依靠双链DNA在含有化学变性剂梯度（DGGE）或者温度梯度（TGGE）的凝胶当中泳动时具有不同的解链行为来实现的。各种类的微生物都拥有其特有的rDNA序列，这些序列可以作为它们的标识，并且均可以通过DGGE或TGGE进行分离。因此这两项技术通常和rDNA分子鉴定技术相结合用于将微生物菌群多样性信息转化为微生物菌群结构信息。与微生物学传统研究手段相比，这两项微生物分子生态学技术最大的特点在于它们是一种不基于培养的方法——它们是以样品的总DNA（或RNA）出发进行研究的，因此能检测到生态体系中大量的不可培养微生物菌群。同时这两项技术还具有可靠性强、重现性高、方便快捷等优点。目前这两项技术被广泛应用于土壤、活性污泥、植物根际、动物肠道、湖泊等各种环境的微生物生态解析中。

上述两项技术虽然是微生物生态研究中解析菌群多样性的重要手段，但是这些技术也存在着难以分析长片段（>500bp）的不足，这对于菌群结构信息的准确获取是十分不利的。具体来说，DGGE和TGGE对200-500bp的rDNA片段具有较好的分离效果，超过500bp则分辨率都会显著下降——这样就会影响到菌群多样性的解析。虽然小于500bp的短片段有利于DGGE和TGGE的分离，但是这样的片段却无法满足之后分子鉴定的需要。因为这样的片段（200-500bp）携带的序列信息有限，对于真菌种属而言，即使是500bp也只占到作为常用的分子鉴定标准之一——18S rDNA全长的1/4左右，所以往往无法对其进行精准的分子鉴定。综上可知，无法通过用于DGGE和TGGE分离的真菌rDNA片段上携带的有限序列信息对其真正代表的真菌种属进行精准的分子鉴定，这是这两项技术在真菌菌群结构研究当中的主要不足。

针对上述不足，目前通常采取和rDNA近全长克隆文库相结合的研究策略。首先提取样品微生物总基因组DNA，扩增其rDNA近全长片段：然后一方面以rDNA近全长片段为模板，采用巢式PCR扩增其可变区；另外一方面克隆rDNA近全长片段，以阳性克隆子为对象，采用菌落PCR扩增其可变区。通过两种方式获得的可变区进行DGGE或TGGE分析，挑选和巢式PCR扩增的可变区条带位置一致的克隆子进行rDNA近全长序列测定。将测定的序列提交到NCBI上利用Blast在GeneBank数据库中进行相似性搜索，以判定对应菌株的种属。这样rDNA可变区只负责微生态菌群多样性解析，而由其全长序列进行微生物种属鉴定，因此该方法可以在不影响菌群多样性解析的前提下提供较为精准的菌群结构信息。但是这种方式将大大增加工作量和实验耗费，此外克隆文库的结果和DGGE（TGGE）的结果存在匹配性的问题，如有时筛选不到对应于DGGE（TGGE）上条带的克隆子，有时出现了DGGE（TGGE）上未曾出现的条带的克隆子。因此，最简便最直接的做法是充分利用DGGE和TGGE的分离原理，从DNA片段本身出发构建特殊构造的片段，使其在保证电泳分离效果的前提下携带更多的序列信息。

发明内容

为了克服上述两项技术在真菌菌群结构研究当中的主要不足，本发明提供了一种利用基于18S rDNA的单双链复合体解析真菌菌群结构的方法，可以在保证分离效果的同时得到更多的序列信息用于分子鉴定，因此将会获得更加精准的真菌菌群结构信息。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案如下：

提取样品中微生物总基因组DNA；基于18S rDNA片段构建单双链复合体并进行DGGE或TGGE分析；割胶回收单双链复合体并将其扩增为完整双链；对扩增到的完整双链进行测序并将测定的序列提交到NCBI上利用Blast在GeneBank数据库中进行相似性搜索；最后根据相似性得分判断对应真菌的种属。

    所述单双链复合体的制备步骤为：首先用磷酸化的引物扩增出大于1000bp的18S rDNA长双链片段；其次用Lambda核酸外切酶处理长双链片段，得到未被磷酸化的单链；最后以该单链为模板，采用单个引物进行一步延伸得到单双链复合体。

    用于DGGE 或TGGE分析时，单双链复合体的双链区不超过500bp。