[发明专利]一种基于LAMP技术快速检测灰葡萄孢的方法

说明书

技术领域

本发明是基于环介导恒温扩增技术(1oop-mediated isothermal amplification，LAMP)对灰葡萄孢(Botrytis cinerea)的快速分子检测方法，可用于多种寄主植物灰霉病的诊断及病原群体发展动态的监测，进行灰霉病的流行预测及早期预警。 

背景技术

环介导恒温扩增反应(LAMP)是2000年由日本学者Notomi等发明的一种新颖的恒温核酸体外扩增技术，该方法利用一套(4种)特异性引物，以识别靶基因的六个特定区域。该技术原理是：在Bst大片段聚合酶的作用下引起自循环链置换反应，60～65℃范围60min内，大量合成目标DNA的同时伴随有副产物——白色的焦磷酸镁沉淀产生。羟基萘酚蓝(HNB)是一种金属离子指示剂，根据反应液中镁离子的变化而呈现出不同的颜色，阴性(没有扩增出产物)时为紫色，阳性(有产物扩增)时为天蓝色。LAMP方法的优势是在恒温条件下进行，不需要循环仪等昂贵的仪器；扩增反应极快，一般在1小时内完成；扩增产生的产物量大，通过肉眼即可判定结果，不需要繁琐的电泳过程；灵敏度高、特异性强；操作简便、快捷，极适于病原的快速诊断及检测。 

灰霉病是一类由灰葡萄孢(Botrytis cinerea)引起的植物真菌病害，可危害200多种蔬菜、果树以及观赏性植物等重要的经济作物，该病的发生可引起植物幼苗、果实及贮藏器官的猝倒、落叶、花腐、烂果及烂窑，造成严重的经济损失。近年来，随着保护地蔬菜生产的发展，加重了灰霉病的发生和流行。目前由于作物种质资源缺少高抗灰霉病的品种，采用化学药剂是控制灰霉病最有效方便的途径之一。灰霉病具有发生快、极易传播等特点，因此以LAMP为基础的分子生物学技术能快速检测灰葡萄孢，该方法具有简单、快速、成本低，灵敏性高等特点，从而大大提高了检测效率，为灰霉病的流行预测、早期预警及综合防控提供理论指导。然而，经检索目前国内外尚未对灰葡萄孢菌的LAMP快速分子检测的相关报道。 

发明内容

本发明的目的是对已有的灰葡萄孢的鉴定及检测方法中存在费时、费力、成本高、准确性低的缺点，提供一种具有简便、快速、省时省力、灵敏度高的检测灰葡萄孢的方法，根据灰葡萄孢基因型，优化反应条件，能在灰霉病发病前期进行大量、快速和简便的病原物群体的诊断和检测，对及时采取有效防治措施、控制病害流行、减少经济损失具有实用价值。 

本发明所述的快速检测灰葡萄孢的分子生物学方法，步骤是： 

(1)在灰葡萄孢Bcos5(BC1G_07633)基因上设计1对外引物和1对内引物，利用该引物在恒温条件下，进行LAMP扩增； 

①LAMP反应所用的两对引物分别是： 

F3：CTACACAACGACCACAGT 

B3：CCACCAGGTAGTTTCAATCC 

FIP：GCCCTCCAGATAATCCATCTATGG-CCCGCGACAATATCATCA 

BIP：CATGCGACCTCCACCACAAA-TTCTTGCGCTTAGTCCAC 

②LAMP反应体系及其条件： 

反应体系(25μL)： 

反应条件： 

63℃ 45min，80℃ 10min； 

(1)对上述LAMP扩增产物观察其颜色变化，并在3.0％琼脂糖凝胶电泳上分离，观察扩增结果； 

(3)鉴定是否为灰葡萄菌菌株：如果LAMP扩增产物显示天蓝色(有产物扩增)，这时电泳图谱应为梯状条带，判定为灰葡萄菌菌株；如果扩增产物为紫色(无产物扩增)，这时电泳图谱无条带扩增，判定为非灰葡萄菌菌株(图1)。 

本发明提供的快速检测灰葡萄孢的分子生物学方法，具有灵敏度高，特异性强等特点，与现有技术相比，本发明的有益结果是： 

1、简便易行：该检测方法通过恒温水浴锅或有稳定热源的设备就能进行实验，通过反应产物颜色变化即可判定结果，省去了昂贵的仪器设备、繁琐的电泳过程； 

2、检测高效性：该检测方法所用检测时间不足1小时，而PCR扩增时间较长，一般需要几小时，这样能大大提高了检测的效率； 

3、灵敏度高：以灰葡萄孢基因组DNA为模板，该方法的检测下限为1pgμL^-1，是常规PCR的10倍；