[发明专利]一种大豆疫霉菌无毒基因Avr1c的特异性检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及了大豆疫霉菌(Phytophthora sojae)无毒基因Avr1c的一种特异性检测方法，能够为大豆疫霉菌无毒基因Avr1c提供快速简便的检测方法，属于生物技术领域。 

背景技术

由Phytophthora sojae Kaufmann & Gerdemann引起的大豆疫病是严重影响大豆生产的危险性、毁灭性病害之一，是中国对外公布的Ⅰ类危险性检疫对象，一般造成5%~10%的产量损失，高感品种几乎绝产。全球每年由于大豆疫病导致的直接经济损失高达十几亿美元（Wrather et al.，2001）。中国由于分离技术上的原因，直到1989年才由沈崇尧和苏彦纯首次在东北大豆主产区分离成功，证实了该菌在中国的存在（沈崇尧和苏彦纯，1991）。此后的10多年内，该菌相继在河南、山东、安徽、江苏、浙江、福建、黑龙江、吉林、内蒙古、湖北、新疆等省被发现并分离（朱振东等，2003）。由于病原菌具有土传的特性和极强的生存能力，其引起的大豆疫病在世界大豆主产区呈扩大蔓延趋势，成为世界性大豆病害。 

大豆疫病是基因对基因病害。由于病原菌的无毒基因与品种的抗病基因是一一对应的，因此研究大豆疫霉菌的无毒基因，可以指导大豆抗病基因的科学合理利用，对防治该病具有重要意义。目前，已经发现并证实的大豆疫霉菌无毒基因有12个。大豆疫霉菌无毒基因的检测方法目前大多采用传统检测方法，即依据菌株对一系列含单个抗病基因鉴别寄主的接种反应，不能发病的，即含有与该抗病基因对应的无毒基因。该方法不仅工作量大，费时费力，接种过程繁琐，而且环境以及鉴别寄主发育状况均会对接种结果产生影响，导致结果不准确。因此开发一种快速、简便而准确的方法来检测无毒基因非常必要。与传统方法相比分子标记方法具有操作简便、迅速、不受外界环境因素影响，短时间内即可处理大量样品等诸多优点，因而具有广泛的应用前景。 

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种简便、快速检测大豆疫霉菌无毒基因Avr1c的分子标记、方法及其引物。 

本发明提供的技术方案是：一种检测大豆疫霉菌菌株中无毒基因Avr1c的特异性引物，是由序列表中序列1和序列2的核苷酸序列组成的一对引物。 

序列表中的序列1由18个脱氧核苷酸组成，序列2由17个脱氧核苷酸组成。 

本发明所提供的检测大豆疫霉菌无毒基因Avr1c的方法，是以待测大豆疫霉菌的基因组DNA为模板，用由序列表中序列1和序列2的核苷酸序列组成的一对引物进行PCR扩增，并以分别含有无毒基因Avr1c-Avr1c和avr1c-avr1c的大豆疫霉菌菌株为对照，如扩增产物中具有与Avr1c-Avr1c同等位置的条带，则说明该待测物中含有大豆疫霉菌无毒基因Avr1c，反之则不含有。 

优化的PCR扩增反应体系为：待测物的基因组DNA模板 100 ng，10 pmol/μl的上游引物（序列表中序列1） 1.0 μl，10 pmol/μl的下游引物（序列表中序列2） 1.0 μl，10 pmol/μl 的dNTP 0.3 μl，10×PCR缓冲液 2.5 μl，25 mM的MgCl₂ 1.8 μl，Taq DNA聚合酶0.2 μl，以去离子水补足至20.0 μl。 

  优化的PCR反应条件为：先94℃ 3 min；随后94℃ 30 sec，56℃ 30 sec，72℃ 60 sec，共40个循环；再72℃ 10 min。通过浓度为1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物中是否有616 bp目的条带。 

  应用本发明可以快速检测一株大豆疫霉菌中是否含有无毒基因Avr1c。 

  本发明以分别含有无毒基因Avr1c-Avr1c和avr1c-avr1c的大豆疫霉菌菌株为材料，利用AFLP（选择性扩增限制性片段）方法结合克隆测序以及引物设计，筛选出适于大豆疫霉菌无毒基因Avr1c的特异性引物，以该引物进行PCR分析，可以快速检测大豆疫霉菌无毒基因Avr1c。本发明方法是一种快速、简便、准确的分子检测手段。 

附图说明

图1为大豆疫霉菌总DNA提取流程；