[发明专利]从玉米中分离出来的PHR基因及其克隆方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及的从玉米中分离出来的PHR基因及其克隆方法和应用。

背景技术

玉米是重要的粮食作物和经济作物，但又属于缺磷敏感的农作物，土壤低磷严重影响着玉米的正常生长发育。潘光堂等通过对多份玉米自交系进行耐低磷力鉴定，筛选出了一批耐低磷种质，耐低磷玉米自交系178就属于其中一个表现优异的种质（张吉海et al.,2008）。研究开发并利用耐低磷玉米自交系178中的优异基因资源，对研究玉米低磷分子机制和培育耐低磷玉米新品种具有重要意义。

植物在遭受低磷胁迫下，会通过磷胁迫信号传递途径，引起一系列相关基因做出应答，调节对磷的吸收、利用、自我平衡，以适应低磷胁迫环境。转录因子调控下游基因的转录起始和表达效率,在基因的调控网络中作用相当于开关基因。在众多磷胁迫应答基因形成的低磷信号途径网络中，MYB类转录因子PHR基因在信号通路中起着至关重要的调控作用。PHR基因属于植物重要转录因子MYB家族中的重要成员，它不仅具有MYB家族含有3个R1R2R3重复结构特征，而且具有预测的coiled-coil(CC)结构域。在许多磷胁迫应答基因的上游顺式元件中，都能找到PHR1的结合位点，成为基因工程改良作物耐低磷的关键靶基因(Franco-Zorrilla et al.,2004)。

在拟南芥中，PHR1基因的突变，引起一系列低磷应答基因不表达或表达量的降低，证明其在低磷胁迫信号通路中的重要作用（Rubio et al.,2001）。最近，有研究表明，PHR1也参与miRNA399的调控，而miRNA399在低磷胁迫中下调了许多应答低磷下游基因的表达。值得注意的是，Zhou等（2008）所在课题组，尽管早先成功地从水稻中克隆了具有bHLH结构域的OsPTF1转录因子，但仍然特别注重研究拟兰芥中具有MYB类结构域特征的AtPHR1转录因子，课题组从水稻中分离出了与该基因同源的水稻磷胁迫转录因子基因（OsPHR2），干涉该基因后抑制了下游基因磷转运子的表达，经过量表达后，显著地提高转基因水稻植株的耐低磷特性。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足提供一种从玉米中分离出来的PHR基因及其克隆方法和应用。

本发明的技术方案如下：

从玉米中分离出来的PHR基因，包括ZmPHR1和ZmPHR2，序列如SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20所示。

所述的PHR基因，编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：22所示。

所述的PHR基因的克隆方法，包括以下步骤：1）取3叶期的耐低磷玉米自交系178幼苗，采用Trizol试剂盒提取总RNA；2）RNA反转录成cDNA：5×PrimeScriptTM Buffer2μL，PrimeScriptTM RT Enzyme MixI0.5μL，OligodT Primer(50μM)0.5μL，Random6mers(100μM)2μL，Total RNA2μL，RNase Free dH2O3μL；37℃反应15min；85℃放置30s终止反应；3）PCR扩增：分别用SEQ ID NO：1-4所示的引物从cDNA中扩增目的基因，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后切下目的片段，用天根的琼脂糖DNA分离试剂盒回收目的片段；4）目的基因克隆：将回收的目的片段和宝生物的pMD19-T载体连接，然后将连接产物转化入大肠杆菌DH5α，经菌液PCR和质粒PCR鉴定出阳性克隆，将阳性克隆进行DNA测序。

所述的PHR基因在耐低磷植物新品种的培育中的应用。

本发明通过玉米PHR基因功能鉴定和玉米PHR基因在低磷处理下的表达分析。以及在模式植物拟南芥中过表达玉米PHR基因，证实其在耐低磷信号通路中的重要作用。

附图说明

图1ZmPHR1全长序列；

图2ZmPHR2全长序列

图3为ZmPHR基因低磷处理下组织特异性表达；a：ZmPHR1在178叶中的相对表达量；b：ZmPHR2在178叶中的相对表达量；c：ZmPHR1在178根中的相对表达量；d：ZmPHR2在178根中的相对表达量；

图4为ZmPHR2酵母转录激活功能验证；

图5为ZmPHR基因超表达拟南芥阳性材料T0代筛选结果；