[发明专利]HCV核心抗原新型定量检测试剂盒的制备方法及临床应用

说明书

技术领域

本发明属于体外诊断技术领域，具体涉及一种HCV核心抗原新型定量检测试剂盒的制备方法及临床应用。

背景技术

HCV是丙型肝炎的病原体,主要通过血液传播.全世界有1.7亿人感染了HCV, 预计我国ＨCV感染者不低于3000万人.与乙肝相比，丙肝更容易转成慢性，约有70％的丙肝有可能发展成慢性肝炎,20％发展成肝硬化,12％发展成肝癌,危害十分地严重.因此,早发现早诊断早治疗对于丙肝患者有重要意义。目前常用检测技术及其局限性。

HCV抗体的检测：自1989年,由丙肝抗体诊断试剂确诊出第一例丙肝感染献血者以来,尽管检测试剂在提高灵敏度方面发展很快,现已经发展为第三代试剂,但窗口期仍然存在.在此期间内,抗体虽未产生,但病毒己存在于血液中。抗体检测对已经康复者和感染活动期患者不能区分不能用于患者的疗效检测，

HCV的RNA检测：定性RNA检测主要用于急慢性丙型肝炎的诊断定量RNA检测主要用于疗效监测该方法在技术和设备上要求较高,且检出率较低,因此难以在常规工作或基层实验室推广,限制了其普遍应用。

HCV核心抗原是HCV基因编码的结构蛋白之一,其AA序列十分保守.有研究发明,核心抗原的滴度水平与HCV的RNA水平十分相关,而且可做为病程进展或抗病毒治疗的疗效监测的指标.HCV核心抗原的检测是一新型的检测方法,研究始于上世纪九十年代中期,应用最广泛的是酶免疫方法。

化学发光免疫法采用标记化学发光物质,具有快速,简便,敏感性和特异性高等特点.用化学发光酶免疫方法检测HCV核心抗原,其最低检出量可达0.06pg/ml,优于核心抗原的普通ELISA检测试剂盒。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的不足，提供一种HCV核心抗原新型定量检测试剂盒的制备方法。 

本发明实现上述目的的技术方案是，一种HCV核心抗原新型定量检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：

1）包被：取单抗CAb1、CAb2，均以5μg/ml的浓度溶解于醋酸盐缓冲液中，以100μl/well加入化学发光板中，4℃孵育16h以上；

2）洗板：用1×PBS、pH为7.2～7.4的缓冲液洗板1次；

3）用封闭液以150μl/well加入化学发光板中4℃孵育16h以上；

4）干燥：在温度18～26℃、湿度＜20%条件下干燥4h；

5）封袋：用铝箔袋抽真空封装包被板 2～8℃保存。

本发明的另一目的在于提供上述HCV核心抗原新型定量检测试剂盒的临床应用，包括以下步骤：

1）样品预处理：56℃下30min；、

2）加样后置37℃下60 min；

3）洗板后加酶置37℃下30 min；

4）洗板后加发光底物，避光反应2-5 min；

5）化学发光仪上检测。

优选地，所述发光底物缓冲液为0.1M、Ph8.5的Tris-HCL。

优选地，发光底物增强剂为0.3 mmol/L的对碘苯酚。

优选地，鲁米诺浓度为3mmol/L。

优选地，氧化剂为7mmol/L的双氧水。

本发明的优势在于：1、采用双抗体夹心的原理，首先采用预处理方法处理标本，可以使抗原-抗体结合物分离，因此对即使已形成抗体的部分样品，也能检测出是否含有HCV抗原；2、选用的发光底物发光性能持续稳定，稳定性好，发光峰值适当，可达到临床应用的要求；3、本发明试剂盒的敏感度为0.4ng/ml，线性范围为0-20ng/ml，批内变异系数<8%，批间变异系数<10%，试剂稳定性好。

具体实施方式

一、HCV核心抗原新型定量检测试剂盒的制备。

1、包被：取单抗CAb1、CAb2，均以5μg/ml的浓度溶解于醋酸盐缓冲液中，以100μl/well加入化学发光板中，4℃孵育16h以上；2、洗板：用1×PBS、pH为7.2～7.4的缓冲液洗板1次；3、用封闭液以150μl/well加入化学发光板中4℃孵育16h以上；4、干燥：在温度18～26℃、湿度＜20%条件下干燥4h；5、封袋：用铝箔袋抽真空封装包被板 2～8℃保存。